腺病毒载体综述
癌症的基因治疗
在多个病例中，根据肿瘤的类型和分布，采用了多种技术来抑制和消除肿瘤细胞。大部分的载体是通过体外肿瘤模型而研制出来的，并且在适宜的动物模型上接受了 检测，其中有些动物模型是通过肿瘤移植方法而建立的。现在，这些途径中有许多已经应用到了临床试验中。正在使用中的治疗方法可分为三类：（i）肿瘤抑制基 因或肿瘤消除基因，（ii）可溶解肿瘤和增强药物敏感性的治疗，（iii）疫苗。
（i）肿瘤抑制/消除基因。由于突变而造成功能丧失的p53 基因与许多种人类肿瘤的形成相关（Wills et al. 1994）。为了治疗这种缺陷并诱导肿瘤细胞的凋亡，已构建了多种携带野生型p53 基因的载体。在开始的研究中，通过适当的肿瘤细胞系及尔后的动物模型系统，证明了这些途径对于退行发育的甲状腺癌（Blagosklonny et al， 1998）、人恶性神经胶质瘤（Cirielliet al.1999； Li et al.1999 a）和乳腺癌（Putzer et al. 1998）治疗的有效性。在有些病例中，载体与某种免疫调节基因如IL-2（Putzer et al，.1998）或与某种细胞毒性药物如阿霉素（Blagosklonny et al. 1998）结合使用，疗效更为显著。检测这些载体对于肺癌、头部癌，颈癌和肝癌的疗效的临床试验正在进行中。然而，这种治疗途径固有的问题之一是载体有效 的靶向性，而经由肝动脉直接注射来治疗肝癌的方法已在一个小鼠模型上经过了试验（Anderson et al. 1998）。最新的研究引人注目地显示了ARF-mdm2-p53 的交互作用在调节p53 基因表达的过程中的重要性，而在多种肿瘤中发现的ARF 和相关的转录因子如Twist（Maestro et al.1999）的一系列突变（Eischen et al.1999； Sanchez-Cespedes et al.1999；Taniguchi et al.1999）暗示了表达p53 作用途径中的其他成分的载体可能也可以达到同样的疗效。其他诱导凋亡的途径也已得到探索，而这些途径涉及到对于细胞周期非常关键的细胞周期蛋白依赖性的激 酶。实际上，其中一种激酶p16 已经在多种人类肿瘤细胞系中显示出有缺损，而表达p21、p15 和p16 的载体也已在肿瘤模型系统中显示出有效治疗的希望（Tsao et al.1999）。表达前凋亡蛋白如Fas 配体和caspase-8 的载体的使用却因载体生产方法存在困难而受到限制。但是，最近所构建的表达腺病毒E3 14。7K 蛋白或表达痘病毒serpin 基因Crm。A 的互补细胞系已提供了良好的生产和探索这些病毒载体的特性的途径（Bruder et al.2000）。另一种促进细胞凋亡的令人感兴趣的途径是核酶的使用，例如用抗H-ras 的核酶治疗膀胱癌（Irie etal.1999），用抗Bcl-2 的核酶治疗前列腺癌（Dorai et al.1999），以及用抗HER2 的核酶治疗乳腺癌（Suzuki et al.2000）。
（ii）可溶解肿瘤和增强药物敏感性的治疗。20 世纪50 年代发现了野生型腺病毒之后不久，就尝试了将野生型腺病毒直接注入肿瘤内，但只显示出局部的疗效。然后直到1996 年才有人宣称，带有E1B 55k 基因突变的腺病毒可选择性地在p53缺陷的肿瘤细胞中复制（Bischoff et al.1996），因此可以作为溶解肿瘤的病毒来发挥作用。这导致了该种突变体（Onyx 015）的商业化发展。而且，虽然有很多文献令人信服地说明原先的前提没有持续下去（Hay et al.1999 a； Ridgway et al.1997；Vollmer et al.1999），但仍然声称静脉注射这种病毒可以有效地治疗某些肿瘤（Heise et al.1999）。与标准的化疗相结合看起来也很有希望（Heise et al.1997），用Onyx 治疗头颈部癌的III 期临床试验正在进行中。另外，最近的一项研究同时使用了E1B缺失的腺病毒和表达IL-2 的腺病毒载体，在一个鼠模型中使p53 缺陷导致的胰腺癌完全消退了（Motoi et al.2000）。
研制出来的另一种选择性地消除肿瘤细胞的策略是通过载体将一种前体药物酶递送到靶细胞中，然后注射一种非毒性药物，这种药物可在原位转变成一种细胞毒素剂 （Crystal.1999）。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）被广泛地作为所谓的自杀基因来使用，因为注射9-1；3-二羟-2-丙氧甲基鸟嘌呤之后，该药物将被 HSV-tk 磷酸化，从而释放出DNA 合成的链终止因子。一技术已经用于头颈部癌的原位治疗（Goebel et al， 1998），并且完成了恶性间皮瘤（Sterman et al， 1998）和前列腺癌（Herman et al.1999）治疗的I 期临床试验。同时缺失E1 和E4 区的病毒载体最近已构建出来，用于传递HSV-tk 基因（Lanuti et al.1999），显然此种载体效果更好。胞嘧啶脱氨酶（CD）也作为自杀基因用于治疗结肠癌，以腺病毒为载体，并且同时注射5-氟胞嘧啶 （Hirschowitz et al.1995）。HSV-tk 和CD 基因的融合基因也被插入到载体中用于治疗前列腺癌（Blackburn et al.1999）。一种含有三种形式的疗法，即涉及到含有HSV-tk 和CD 双自杀基因载体结合放疗的疗法，以证明对于一个宫颈癌异种移植物的肿瘤消减非常有效（Rogulski et al.2000）。另一个令人感兴趣的途径是与CD 载体共注射一种含有尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的载体。在一个大鼠肿瘤模型中，这一途径极大地增加了系统的敏感性（Adachi et al.2000）。这些疗法还伴随出现了所谓的“旁观者效应”，增强了细胞毒效应（Zhang & DeGroot.2000）。
递送各种细胞因子的载体可以补助含有自杀基因的载体的作用，从而增强原位的细胞毒性（Cao et al.1998）。
在所有的这些系统中，很明显的一点是，如果靶向性更高，疗效将会大大增加；组织特异的启动子可以整合进入载体中以促进这一点的实现（Hart.1996）。已有报道这一技术在乳腺癌（Manome et al.1994）、肝癌（Kaneko et al.1995）和黑色素瘤（Siders et al.1998 a）治疗中的应用。然而，虽然在体内已经实现了目标的特异性，但结果经常令人失望，因为启动子的活性相当低。一个试图改善这一不足的尝试采用了一种精巧的 策略，该实验在一个动物模型中使用了Cre-lox 系统（补体受体增强作用-液氧系统）和一个肿瘤特异性抗原，由此获得了很有希望的结果（Kijima et al.1999）。
还应该列出关于在载体中保留E1A 基因的重要性的文献，因为在这些病例中，这种载体能够促进P53 转录，同时提高肿瘤细胞对细胞毒性试剂（Brader et al.1997； Cook et al.1999； Wildner et al.1999）和对放疗（Martin-Duque et al. 1999）的敏感性。
（iii）疫苗。对于激活抗肿瘤细胞免疫的策略已经通过载体的使用进行了探索。在这些尝试中，多种免疫调节基因和/或肿瘤特异抗原基因通过载体导入体内。 许多细胞因子可以以这种方式发挥作用：如此，IL-2 能够诱导CTLs，促进NK 细胞的活性，并促使肿瘤浸润淋巴细胞的成熟；高剂量的重组IL-2 和IL-2 表达载体成功地消减了动物模型中的肿瘤。然而，毒性问题变得突出起来（Toloza et al. 1996），后面的研究便集中于对其他细胞因子更为定向的递送，包括IL-12（Bramson etal. 1996； Gambotto et al. 1999； Mazzolini et al.2000； Siders et al.1998 b），有时候是与IL-2（Addison et al.1998）和肿瘤抗原（Hirschowitz & Crystal.1999）结合使用。将表达IL-2 或IL-12 的载体与表达淋巴细胞激活素（lymphotactin）的载体组合进行瘤内注射，在小鼠的乳腺癌模型系统中取得了成功（Emtage et al.1999）。意识到多种肿瘤会呈现肿瘤特异抗原这一点，激发了表达这些抗原的载体的使用，这类载体可以发挥促进抗肿瘤免疫反应的作用；由此进行了用表达 MART 1或gp100 的腺病毒载体治疗转移性黑色素瘤的试验（Rosenberg et al. 1998）。这些结果证实了高剂量腺病毒载体的注射给药是安全的，但是针对载体出现的免疫反应却消除了长期的抗肿瘤效应。在一个结肠癌模型系统中（Li et al.1997），通过腺病毒载体表达的肿瘤抗原使肿瘤出现了明显地消减，并诱导了进一步的针对肿瘤的免疫反应。另一个前景很好的增强抗肿瘤免疫反应的途径是根 据体内树突状细胞具有有效呈现抗原的能力。有人建议，一个有效的策略将是从病人体内分离出树突状细胞，用表达适当的肿瘤抗原的腺病毒载体来感染，将之改造 并回输到病人体内，同时结合标准的疗法（Crystal.1999）。 对人树突状细胞的研究显示，用腺病毒载体改造的树突状细胞其成熟度和功能不会受到影响（Rea et al.1999； Zhong et al.1999），转移性肺癌的明显消减已经由鼠的树突状细胞而获得（Wan et al. 1999）。一个黑色素瘤的鼠树突状细胞模型也通过腺病毒载体显示出显著的抗黑色素瘤免疫反应的增强（Tuting et al.1999）。使用双特异性抗体使病毒再定位于细胞表面的CD40 受体上可以大幅度提高载体对树突状细胞的靶向特异性（Tillman et al.1999）。这一技术亦促进了细胞的成熟，因此增强了它们的免疫激活特性。表达CD40 配体的载体可以直接导入肿瘤细胞内，并且在动物模型中促进了抗原呈递能力，使肿瘤消减（Kikuchi & Crystal.1999）。相关的其他策略涉及到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的载体表达（Ozawa et al.1999），以及增强树突状细胞对编码TGF 1（肿瘤生长因子 1）的载体的耐受性（Lee et al.1999 b）。最近的研究显示，树突状细胞可以用与其自身CAR 状态无关的载体来感染，而且这些细胞可以呈现出适当的CTL（肿瘤特异性杀伤T 淋巴细胞）效应（Linette et al.2000）。