腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
事先准备好用于包装病毒的293A 细胞和病毒质粒，转染每个直径为6cm 的培养皿complex 成分如下：
穿梭质粒 2μg
p-BHG(delta)E1,3 cre 4μg
转染后6h 换新鲜培液。
（二）病毒收集
病毒收集前要观察病毒空斑是否形成，为限制病毒的扩散及空斑更好的形成，通常在培养液中加入琼脂糖，感染后7 天左右可以在显微镜下看到小的空斑，一般在10 至21 天内形成，空斑形成后连着琼脂糖一起将空斑挑起，放入新鲜培养基中过夜。
（三） 病毒扩增
第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A 细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1 代病毒，以P1 代腺病毒感染293A 细胞，连续进行三代感染，至P4 代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。
（四）病毒纯化
病毒纯化采用CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，CsCl梯度的制备方法如下：加入2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液（溶剂同 上），然后缓慢加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒悬浮液。20000rpm，室温离心2小时。收集密度在 1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中（透析袋使用前用10mM的EDTA－Na2煮沸10min）。在透析缓冲液（50g蔗 糖，10ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2ml 1M MgCl2定容至1L）中，4℃搅拌透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。
（五）病毒重悬和保存
500ul PBS 重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4 度冰箱保存，如需长时间存放需置于-80 度甚至液氮保存。
五、感染目的细胞
因为不同细胞的MOI 不同，所以在将病毒感染正式感染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的病毒数。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到24 孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。
（二）病毒感染
I、贴壁细胞
感染实验分为两组，分别添加相应腺体病毒载体和等滴度同体积的对照病毒载体。加入的病毒量范围在MOI=20～50 内，每个MOI 值加两个孔 24 小时后换液。
II、悬浮细胞
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后， 低速离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分 上清，然后加入适量的病毒液，室温放置10min（不能超过半小时），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染即可。
（三）观察感染情况
感染24 小时后， 可以开始观察到GFP/RFP表达（ 只对于有GFP/RFP独立表达框的腺病毒载体），过表达和干扰的感染时间以36-48小时实验为最佳。
六、动物实验
将纯化过的腺病毒以每只小鼠 1-5×109 毒量注射，比如纯化腺病毒滴度为 1×1011PFU，则每只小鼠注射体积约为 10-50ul。具体的注射量需要实验摸索，注意注射体积不要超过 200ul，最好控制在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。