腺病毒载体操作手册

各载体用途如下表：

2） 骨架质粒信息如下：

2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
 

三、包装细胞293A 细胞的培养
（一） 293A 细胞的冻存
293A 细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表 型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A 细胞则能连续培养3~4 个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A 作为第一代，则30 代内能得到最佳结果。随着传代的次数增加，293A 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻 存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去残留的培养基；
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10%DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10% DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计 数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO），重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。
6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
（二）293A 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。
2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。
4、将培养皿平稳放回37℃、5%CO₂ 和95%相对湿度的培养箱中培养。
（三）293A 细胞的复苏
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为37~42℃的水浴。
2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全溶解。
3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6cm 培养皿。
5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO₂ 和95%相对湿度的培养箱中培养。
6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。
 

编辑： snail    来源：丁香园