胎儿染色体数目异常是引起自发性流产的最重要原因,主要发生机制是配子减数分裂过程中随机性的发生染色体不分离。此外,若父母本身存在染色体的平衡易位,其后代则会有几率遗传到异位染色体而造成复发性流产。临床染色体检测的方法很多,如核型分析,基因芯片等,但复杂的实验操作和昂贵的价格使得这些技术在当前无法广泛应用。 近期,发表在 Prenatal Diagnosis 的一篇论文介绍了一种新的方法(CNVplex®)用于基因组全部 24 条染色体(22 条常染色体和 2 条性染色体)的倍性检测,揭示自发性流产是否由染色体异常引起。同时,这种方法可以检测到染色体末端重复,提示父母一方或双方可能存在染色体平衡易位,因此需要进行核型分析,及时采取措施预防流产的再次发生。在检测准确性上,CNVPlex® 与基因芯片一致,但成本却是后者的十分之一。 天昊研发团队已经将这种技术转化为适用于临床的染色体非整倍检测试剂盒,方便快捷的对流产原因进行排查,减轻孕妇心理负担,提供遗传学信息从而辅助临床医生提出合适的指导方案。天昊同时提供对流产组织样本以及母亲基因组 DNA 进行个体鉴定(STR 分析),排除可能的母系污染,大大加强了结果的可信度。 至今为止天昊诊断也已持续研发多种临床筛查和诊断的产品,从孕前,产前到新生儿覆盖整个生育过程。其中包括孕前夫妇遗传病携带者筛查,男性不育相关基因检测,新无创 TM 产前胎儿唐氏综合征筛查,遗传性耳聋 90 项检测,新生儿遗传病筛查,以及高发单项遗传病检测项目(如地贫,DMD,成骨不全,X 脆性综合征等)。天昊诊断一直致力于创新基因检测科技,实现科研向临床的转化,以更好的防治出生缺陷,守护人类健康。 下面小编带大家回顾这篇研究,了解 CNVplex® 在其中的表现。 英文题目:A copy number variation genotyping method for aneuploidy detection in spontaneous abortion specimens 中文题目:一种用于散发性流产产物的染色体非整倍体筛查方法 期刊名:Prenatal Diagnosis IF: 3.043 单位:上海交大医学院,国际和平妇幼保健院 方法: CNVplex® 和 aCGH 探针分布:研究者在 24 条染色体的的着丝粒两侧以及端粒附近设计探针,平均每条染色体覆盖 5-8 对,共计 170 对(探针分布如下图: 其中 1-12 号染色体,16 和 17 号染色体有 8 对探针;18-20 号染色体,X 染色体上各有 7 对探针;13-15 号染色体,21-22 号染色体及 Y 染色体上各有 5 对探针),用以检测每条染色体靶定区域的拷贝数情况。因此 CNVplex® 不仅可检测 24 条染色体的数目异常,对于染色体的末端缺失或重复的情况也可以进行检测。 摘要: 染色体的异常,如染色体非整倍体已被证明是引起自发性流产的最主要原因,但对于流产的遗传学原因的分析,临床上并没有广泛开展。对流产物进行染色体非整倍体的检测有助于揭示流产的病理。在这项研究中,我们使用一种高通量连接探针扩增法(High-throughput Ligation-dependent Probe Amplification ,HLPA)商业名 CNVplex® ,检测流产物中 24 条染色体的倍性信息,并验证此方法在其中的表现(有效性及准确性)。 结果: 1. 染色体拷贝数的判定 首先,研究者对 23 个正常 DNA 样本进行拷贝数的检测,得到了正常样本(拷贝数为 2)的拷贝数值分布。下图(Figure 2)为 23 个正常对照样本的拷贝数结果(分布在 24 条染色体的 170 个探针上),可见拷贝数的范围落在 1.6-2.4 之间(虚线)。所有对照样本的拷贝数平均值为 1.990 (s.d. = 0.131) 。根据所得结果研究者定义其值大于 2.5 为目标区段的拷贝增加,低于 1.5 为拷贝缺失。具体为数值在 2.5-3.5 提示检测样本为三体,0.5-1.5 提示为单体,对于嵌合体 (样本中部分细胞正常,部分为非整倍体的现象), 研究者通过三个连续探针拷贝数在 2.3-2.5 之间或者在 1.3-1.5 之间为标准,提示样本可能为三体嵌合或者单体嵌合。为了确诊待测样本是嵌合体还是母系污染,需进行 FISH 检测或者 STR 分析。考虑到操作简便,且成本较低,研究者选择了 STR 分析对母亲和胎儿的 DNA 进行鉴定以排除母血污染。 Figure 2. 23 个正常对照样本在 170 个探针位置相应拷贝数值。 注:盒型图代表 23 个样本在此位置的拷贝数中位数以及阈值范围,Y 染色体的拷贝数结果只统计了男性样本。 2. 流产物样本中染色体非整倍体情况 本研究通过 HLPA 和 aCGH 分别检测 98 例自然流产组织中染色体拷贝数情况,并对两种方法的结果进行了比较,发现中 HLPA 方法检测得到的结果与 aCGH 完全一致,其中 Figure 3A 展示了其中一例样本,aCGH 和 HLPA 都清晰的显示胎儿为 2 号染色体三体。 98 例样本中 49 例被检测到为染色体非整倍体,我们对染色体变异的类型进行了统计:包括 2 号染色体三体异常 3 个,3 号染色体三体异常 1 个,6 号染色体三体异常 1 个,8 号染色体三体异常 1 个,9 号染色体三体异常 1 个,10 号染色体三体异常 1 个,11 号染色体三体异常 1 个,12 号染色体三体异常 1 个,13 号染色体三体异常 1 个,14 号染色体三体异常 1 个,15 号染色体三体异常 2 个,16 号染色体三体异常 15 个,19 号染色体三体异常 1 个,10 号染色体三体异常 2 个,21 号染色体三体异常 3 个,22 号染色体三体异常 2 个,X 单体异常 9 个。16 号三体为本研究检测到最多的染色体数目异常 (30.6%),这与之前的研究是一致的。 对样本 7120177(编号)而言,aCGH 显示其在 2 号染色体上 Cy5/Cy3 荧光比例上升,但并不显著 (Figure 3B). 相同的, HLPA 检测结果显示靶定在 2 号染色体的 8 个探针拷贝数的平均值仅为 2.51(分别为 2.35, 2.62, 2.66, 2.40, 2.45, 2.47, 2.72 和 2.40),其中 3 个连续探针拷贝数在 2.3-2.5 之间。这些结果提示样本 7120177 可能为嵌合体。 Figure 3. 待测样本 7120158 (A) 和 7120177 (B) 分别运用 aCGH 和 HLPA 得到的拷贝数结果 注:X 轴代表各染色体(chr1-chr22,X,Y),aCGH 中 Y 轴的值为 log2(Cy5/Cy3) (待测样本与正常男性样本的荧光比值). 数值超过绿色的线或者低于红色的线分别代表待测样本为三体或者单体。在 HLPA 检测中,Y 轴代表所计算出的拷贝数数值,黄线之间的为正常样本拷贝数(2)的范围. (B) 待测样本 7120177, aCGH 检测结果显示 2 号染色体荧光信号有轻微上调,HLPA 检测结果显示 2 号染色体拷贝数平均值为 2.51,均提示该样本为嵌合体或被污染。 3. 样本嵌合或污染确认 对待测样本 7120177 进行了 Short tandem repeat (STR) 鉴定 , 以确认是样本本身是嵌合体或外源 DNA 污染导致。结果见表 1。研究者发现此样本在所有 STR 位点只显示 2 个等位基因,因此样本并没有被外源 DNA 污染,从而确定其为 2 号染色体三体的嵌合体。 表 1:样本 7120177 STR 检测结果 结论: 1. 对自发性流产物进行染色体非整倍体检测十分重要 据之前的报道,50%-70% 的流产是由于胎儿的染色体异常导致。而多种因素与其有关,比如母亲的年龄,随着年龄升高,胎儿染色体异常的概率也会加大。大部分的染色体数目异常都是随机发生的。然而,复发性流产则有很大几率与父母的染色体平衡易位有关。因此判断流产的遗传学原因可以帮助夫妇明确病因,选择合适的临床解决方法。比如,如果检测到流产物 DNA 有染色体末端重复,需对此夫妇进行核型分析以排除平衡易位的可能性。 2. HLPA(CNVplex®)是一种操作简单,经济有效的染色体非整倍体检测方法,非常适用于临床流产物的分子遗传学分析; 染色体核型分析是诊断染色体异常最经典的方法,它可以检出染色体数目异常以及大于 4Mb 的染色体结构异常,但需要活细胞培养,操作繁琐,且费时(约 10 天左右);其他的技术如 SNP 芯片,aCGH,NGS 法等,性价比都不高,也不适用于普遍快速筛查,而像 FISH,MLPA 等技术的限制性在于其通量不高,与这些技术相比,HLPA(CNVplex®)延续了 MLPA 的特点,特异性强,检测波动小(<10%)。 3. HLPA(CNVplex®)的局限 这一体系通过参照位点检测拷贝数,所以不适合检测多倍体,这与 MLPA、aCGH 是一样的;文章中使用的探针组分辨率有限,不能检测染色体微缺失微重复或者平衡易位的情况。此外,这一技术本身无法排除外源 DNA 的污染,所以需要使用 STR 分析排除可能的母血污染(尤其当核型为 46,XX 时)。但是,CNVplex®本身的高准确性以及低成本,使得它非常适用于自发性流产的临床普筛。 关于天昊诊断 天昊诊断自创立之初坚持以技术创新作为公司发展核心动力,基于目前国际流行的基因检测平台开发了多项创新技术,其中包括 AccuCopy® 多重基因拷贝数检测技术,CNVPlex® 高通量基因拷贝数检测技术,iMLDR® 多重 SNP 及突变分析技术,SNPscan® 高通量 SNP 及突变分析技术,EasyTarget® 多重基因片段快速富集技术, SNPseq® 超高通量 SNP 及突变分析技术,CNVseq® 超高通量基因拷贝数检测技术等具有国际水平的专利技术,希望通过自主研发的创新技术促进国内基础医学遗传研究以及人类各种疑难疾病的致病机理的探索,同时利用这些技术开发适合临床应用的各类基因检测产品,服务于我国人民大众的健康事业,同时还致力于科研相关试剂的研制与开发工作。因此,公司始终将"创新基因科技,守护人类健康"作为公司长期发展的核心理念。 |