微板及酶免自动化的过去、现状与未来(一)
2016-08-12
王兆强 陈正斌 包静 张钰婷 (澳斯邦生物工程有限公司) 2000年,迎接新千年之际我应邀撰写了《酶免试验的自动化与网络化》一文,介绍传染病原的酶免检测自动化分析。彼时正是PCR检测刚刚进入欧美的临床和血液筛查市场,大家关心的是蛋白免疫分析能否将被PCR替代、如何快速发报告等等。后来这篇文章在中国网络上广泛传播,成为大家了解这个领域的入门之参考。十几年过去了,当下的主题是“精准医疗”,而中国市场流传着免疫分析将被管式化学发光系统取代。受CAIVD之托,再次更新撰写酶免分析进展。本次,我把自己多年的研究与学习,富集知识、历史及业界动态一并综述,将主题细化,形成了本文题目,谨供有关人士针对精准医疗目标,利用微板技术发展高通量、高内涵、高分辨之大数据采集作为参考。 第一章 酶联免疫分析技术 (Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA) 1952年美国威斯康星大学的理查德·高德伯格(Richard J. Goldberg)首次发表了正确描述抗原-抗体反应文章,形成了抗原-抗体反应的“高德伯格理论” 这是现代蛋白免疫理论与应用的基础[1] 。 最早的基于抗原-抗体反应的免疫蛋白特异性检测技术,是建立于1960年的放射免疫分析技术(RIA)。美国纽约退伍军人管理局医院的所罗门·伯森(Solomon Berson) 和罗莎林·雅洛(Rosalyn Yalow,图1)最先发表了内源性血浆胰岛素的测定[2]。为此,罗莎林·雅洛独占了1977年诺贝尔医学奖的一半,以表彰她建立肽类激素的放射免疫分析技术。虽然,伦敦米德塞科斯医院的罗治·伊金斯(Roger Ekins)博士也在1960年发表了他的发现,利用饱和分析(saturation analysis)检测血浆的甲状腺素[3],但并未有缘诺贝尔奖。 尽管免疫蛋白特异性检测技术的早期应用,采用了竞争性原理以便在均相反应体系(homogeneous reaction)下定性和定量测定未知物,但是为了洗涤移去、排除未结合的抗体或抗原来保证检测的特异性specificity、真实性fidelity,就必须将抗原或抗体固定到一个固体(如孔壁)上,这就是异相免疫分析逻辑的建立。瑞典乌普沙拉大学的Leif Wide和Jerker Porath在1966年发表了固相免疫技术(Solid-phase technique)原理[4],这是人类认知能力的进步。 自60年代起放射免疫分析技术迅速发展,就已经开始采用亚克力手工制作的微板。1965年由美国的Cooke Labs(现在更名为Dynex Technologies)上市了亚克力注塑工艺的96孔微量滴定检测板Microtiter,以高通量来平衡复杂费时的操作。直到70年代初期,大多数放射免疫试剂基本上是由研究人员自己“家酿”的,并需要在特殊的放射防护实验室里操作。后来,德国Boehringer-Mannheim (宝灵曼)公司, 美国Abbott (雅培)公司及荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司等成为最早的放射免疫试剂制造商,提供初步标准化、经济合算的RIA试剂盒。 放射免疫分析(RIA)在80年代末期达到高峰并开始衰落(发展趋势统计见图2)[5],是因为另外一项更简洁、更安全的技术出现和快速发展,这就是始现于70年代初期的酶联免疫技术(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA) 。 酶联免疫分析(ELISA),是用酶标记替代放射物标记,并利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的一种免疫技术。由于ELISA可用于几乎所有的可溶性抗原抗体的检测、没有放射性污染,避免了潜在的人体伤害,并由于酶催化底物显色有很强的放大作用而无需昂贵的测试仪器,这使得基于微板的酶联免疫分析成为临床检验、药物开发和生命科学等实验室最基本的工具。1971年,瑞典斯德哥尔摩大学的彼得·皮尔曼(Peter Perlmann) 和伊娃·尹格瓦(Eva Engvall),荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司实验室的安童·舒尔茨(Anton Schuurs) 和宝科·范维曼(Bauke van Weemen),以及法国巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分别独立地发表了辣根过氧化物酶HRP标记的应用文章,建立了酶联免疫分析方法[4]。 Organon Teknika (欧伽侬)公司最早在生殖内分泌领域商业化了血浆hCG、总雌激素、人胎盘催乳素等酶免试剂,这一时期产品在灵敏度方面还不能与RIA试剂媲美,所以尽管申请了美国专利US762120等知识产权,但直到80年代初期市场表现并不成功。 70年代初期在血液筛查开始的乙肝病毒检测,促进了ELISA技术及其相关设备的自动化的发展。在选择具有放射性危险的半自动RIA系统,或选择缓慢复杂的血球凝集滴度试验,或是操作明晰的ELISA技术,血液筛查市场选择了ELISA技术。 1976年Organon Teknika (欧伽侬)公司上市96孔微板的乙肝表面抗原ELISA试剂HEPANOSTIKA 得了高度成功,这是世界上第一个商业化的ELISA试剂盒(图3)。同年4月,德国临床化学学会(DGKC)向瑞典人皮尔曼和尹格瓦,荷兰人舒尔茨和范维曼四人颁发了德国科学大奖“Biochemische Analytik”(生化分析,图4)。当然遗憾的是,这个针对ELISA发明的颁奖,并没有影响到第2年的诺贝尔医学奖-RIA发明的评选。 导致ELISA试剂取代RIA试剂的真正推动力,是来自80年代初期单功能的自动化设备开发。这些设备包括,瑞士Hamilton(哈美顿)的Micromedics自动加样设备,芬兰LabSystems(雷勃)的多通道加样器, 酶标仪及洗板机,德国宝灵曼的全自动酶标系统。这些设备的自动化以及操作简便,使得许多内分泌激素测定和传染病检测由特别污染/废弃物管制的放射同位素科,可以转入到普通的实验室进行。此外,瑞典人皮尔曼和尹格瓦没有将ELISA申请专利,而Organon Teknika (欧伽侬)公司后来虽然申请了,却没有独霸,而是专利许可了超过100家公司,这也是普及ELISA的发展动力之一[6]。 从此,ELISA作为一种非放射标记的免疫分析技术开始在世界各地实验室成为常规的检测手段,不但为人类健康和疾病临床诊断、治疗监控提供特异性的数据,而且也触发了体外诊断(IVD)工业的形成。在2012年,商业化免疫分析市场已经达到了170亿美元的规模(见图5)[6]。许多临床化学家也发展成为临床免疫学家,酶联免疫分析技术是一项伟大的发明。 图5 2012年免疫分析市场规模与分化[6] 中国的免疫分析诊断工业起步于70年代初期。时任北京医科大学人民医院检验科主任的陶其敏教授(见图6),在1973年10月自行研制出中国第一套乙肝检测血凝法试剂盒,开启中国病毒抗原-抗体免疫检测时代。成立于1985年的北京北方生物技术研究所或许是中国最早的放免试剂生产商。1990年中国医学科学院基础所内分泌室陈克铨教授最早开发了96孔微板的hCG检测的ELISA试剂盒,用于早孕检查。1988年10月10日,解放军军事医学科学院基础医学研究所正式创建“北京四环生物工程制品厂“,并于1991年独家获得乙肝五项ELISA试剂的生产文号和新药证书,这是中国最早的用于传染病检测的ELISA试剂。 表1是2011-2015年五年间中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项ELISA试剂盒进行批批检的数据表,仅这四项血液筛查的试剂,每年的年测试总量达5亿次,这意味着每年大约有5亿以上的人次,至少每人做一项检测。这个数字并不包括,采用发光免疫检测的临床市场(特别是进口产品),临床检测的总量应该不少于血液筛查的检测量。 表1 2011-2015年中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项EIA试剂盒进行批批检的数据
人份 |
2011 |
2012 |
2013 |
2014 |
2015 |
HBsAg 检测总量 |
193,865,400 |
177,504,112 |
175,693,824 |
201,973,568 |
179,364,336 |
其中进口试剂总量 |
5,054,208 |
5,451,264 |
5,875,200 |
6,181,920 |
1,973,280 |
anti-HCV检测总量 |
113,947,648 |
111,195,456 |
111,196,976 |
125,726,208 |
125,126,592 |
其中进口试剂检测总量 |
5,876,640 |
5,421,600 |
5,849,200 |
5,861,280 |
4,167,840 |
anti-HIV检测总量 |
126,978,278 |
129,097,152 |
135,855,744 |
132,163,680 |
147,749,088 |
其中进口试剂检测总量 |
4,634,112 |
8,077,920 |
7,911,840 |
11,561,280 |
11,722,560 |
Syphilis检测总量 |
81,232,512 |
85,133,088 |
87,528,000 |
90,047,328 |
103,279,200 |
其中进口试剂检测总量 |
125,760 |
802,560 |
715,680 |
624,960 |
148,800 |
四项检测总量 |
516,023,838 |
502,929,808 |
510,274,544 |
549,910,784 |
555,519,216 |
其中进口试剂检测总量 |
15,690,720 |
19,753,344 |
20,351,920 |
24,229,440 |
18,012,480 |
毫无疑问,以上数据表明,中国是世界上最大的ELISA试剂生产国和消费国。 50余年来,基于96孔微板的ELISA技术已经成为各种实验室最基本的检测手段,蛋白免疫特异性分析为基本的临床诊断、治疗检测以及药物研发,提供了大量数据。 过去的50余年来,人们不断地试图对基于微板的ELISA技术的各个环节,进行创新、改进,以便将这项伟大发明的应用,提升到更新更高的水平。例如,在自动化平台上,新的或替代的ELISA形式正朝向微量化(miniaturized)或微流体(microfluidic)组件发展;微板的包被正在实现全自动化,以提高试剂的精密度;试剂盒组份正在”聪明化“(cartridge-based reagents),以减少试剂试验的准备时间等等。在试验操作上,改进洗板自动化提高洗涤效率,以适应第4代高包被(high binding)的高灵敏度需要;采用发光底物来改进传统比色在高浓度(OD值大于2.0)检测的低分辨率,拓宽定量动态的线性范围;在固相载体上,使用磁珠或微粒,以减少包被蛋白与检测蛋白扩散(diffusion)距离,缩短了抗原-抗体结合平衡时间,还增加了多蛋白包被组合的可能性。 无论如何,微板作为N x 96个微试管处理单元,其设计本质就是批量、整体处理这些微试管,以便在复杂的试验过程中提高总体效率,这就是人们在不停地发展这项技术的原因。 毫无疑问,在精准医疗概念下,我们需要更细致、更大量的蛋白数据作为诊断信息,以支持精准治疗,因此,具有高通量(High-throughput screening,HTS)、高内涵(High-content screening,HCS)、高分辨(High-resolution screening,HRS)特征的基于微板的ELISA技术,将在蛋白和核酸分析方面出现新的发展。 下面,我们将分别以微板及酶免自动化的过去、现在进行全面综述,以展望未来的ELESA前景。 第二章 微板 (Microplate) 1.微板发展进程 作为检测分析器皿,微板最早是由匈牙利医生、科学家和发明家 Gyula Takátsy于1951年手工制造而成。当时匈牙利流感疫情严重,需要找到了一种快速、经济和可靠的测试方法来鉴别流感病毒。采用当时的标准测试方法,需要很多试管进行系列稀释,过程繁琐,成本高并费时,且结果并不太可靠。Takátsy采用管挨着管、线性回路式进行布局,就可以对多个试管同时加入等量标本,大大地提高实验标本的处理通量,这就是8×12孔的96孔微板的由来。 最初商业化96孔微板是用亚克力注塑的,主要应用还局限在血凝抑制试验,由于便于系列稀释操作,使得微板在病毒和血清滴度测试中发挥主流作用。直到开始使用聚苯乙烯polystyrene注塑的微板作为蛋白吸附固相载体,才使得96孔微板在RIA和ELISA中成为核心作用。 图7 微板的商业化进程 经过50余年的开发,2:3矩阵形状的微板已经千姿百态、形式各异,以适应高通量的应用。从反应孔密度来分,已有6孔、24孔、96孔、384孔 (诞生于1992年)以及1536孔微板(诞生于1996年),甚至3456孔微板(诞生于1996年)和9600孔微板(诞生于1997年)也在开发中。但受表面张力的影响,高密度384孔和1536孔微板,在加样、洗板等处理成为瓶颈,至今没有商品化试剂盒供应;而受液体蒸发的影响,超高密度的3456孔和9600孔微板的应用更加困难。但是,强大的高通量、高内涵的大数据需求,迫使人们持续追求高密度孔微板的处理解决方案(图7)。 此外,根据分析测试需要,微板在除了光学透射传统格式外,其他方面处理也在变化中。如,为了避免密集的孔间所产生的串扰(cross-talk),采用荧光测试时就选择黑色板材;采用发光测试时就选择白色板材;当采用顶部荧光测试时,选择孔底实心不透的;而采用底部荧光测试时就需要孔底透明的。为了吸附蛋白、核酸,就选择聚苯乙烯材质并做表面处理增强结合量;为了避免吸附蛋白和核酸的长期存储,就采用聚丙烯、COP等疏水、保湿强的塑胶。表面涂层也是微板处理的经典手段,目的是降低非特异性结合,增强细胞组织培养固着等等。 在微板的发展史上,重要发明事件在下面编年表2中,由此可鉴,这是多么不一般的塑料板! 表2 微板重要发明事件编年表
年代 |
创新者 |
隶属机构 |
主要贡献 |
1951 |
Dr. G. Takatsy |
N.I.P.H. Hungary |
机加工的72/100孔亚克力微板 |
1952 |
Dr. G. Takatsy |
N.P.H. Hungary |
首款机加工的96孔V形底孔亚克力微板 |
1953 |
Mr. John Liner |
Linbro Company |
首款真空成型的96孔微板 |
1963/1964 |
Drs. Sever & Cooke |
N.I.H. Labs USA |
首款模塑的96孔微板 |
1965 |
Cooke |
Cooke Labs USA |
设立公司,使用亚克力及后来的聚丙乙烯制造96孔微板 |
1966 |
Dr. Knebel |
Griener Labs |
在欧洲首次生产96孔板 |
1968 |
Cooke |
Cooke Labs USA |
微板Microtiter专利发布以及商标注册 |
1968/1969 |
未知 |
Falcon (now BD) |
6孔PVC加热成型板诞生 |
1968/1969 |
N.A. |
Dynatech Labs |
Dynatech公司收购美国库克Cook Labs公司 |
1969/1970 |
Dr. Morningstar |
Data Packaging Corp. |
定制Microtiter酶标板塑模 |
1970 |
N.A. |
Dynatech Labs / Data Packaging Corp. |
成立著名的CoStar合资公司 |
1971 |
Cooke |
N.A. |
起诉John Liner,导致微板专利宣告无效 |
1972 |
N.A. |
Dynatech Labs / Data Packaging Corp. |
二家的合资公司解散 |
1972 |
Dr. P. Cleveland |
Univeristy of Minnesota |
首次出现具有过滤管腔的微板 |
1974 |
Allister Voller & Ken Walls |
London and CDC |
ELISA试验上开始使用微板 |
1975 |
Greg Mathus & team |
CoStar division of DPC |
微板格式重新设计 |
1975 |
Griener Labs |
Griener Labs |
平底和U型底的8孔条微板 |
1976 |
未知 |
Falcon (now DB) |
开始塑模生产96孔微板 |
1976/1980 |
N.A. |
Corning, Nunc |
Corning公司和Nunc公司进入96孔微板市场 |
1979 |
A. Thorne |
Dynatech (Dynex) |
可组合的单板条和板架Removawell™微板 |
1980 |
Dr. P. Cleveland |
V & P Scientific |
首款具有玻璃纤维滤芯GF discs的微板 |
1980 |
Dr. P. Cleveland |
V & P Scientific/ Schleicher & Schull |
首款96孔斑点印迹腔微板 |
1981 |
Kivosky et al |
Millipore |
机制96孔滤芯微板 |
1981 |
Dr. Cleveland |
UCLA at San Diego |
首款96孔滤芯微板专利 |
1982 |
A. Thorne |
Dynatech (Dynex) |
首款有色(黑和白)微板 |
1983 |
A. Thorne |
Dynatech (Dynex) |
在欧洲发表了有颜色微板专利 |
1983 |
Dr. M. Jolly |
Pandex (now Iddex) |
首款96孔滤芯底黑色微板 |
1984 |
Roy Manns |
Meipec |
设计首款无串扰信号的滤芯微板 |
1984 |
Roy Manns et al |
Genemed Engineering |
首个双件组合的滤芯微板专利 |
1985 |
Roy Manns et al |
Genemed Engineering |
生产硝化纤维素滤芯微板 |
1985 |
Dr. P. Cleveland |
V & P Scientific |
首款有12孔滤芯板条的96孔微板 |
1986 |
Roy Manns |
Genemed Engineering |
接手微板开发 |
1987 |
Dynatech研发团队 |
Dynatech Labs |
带有8孔和12孔板条的96孔微板 |
1987 |
Manns, Saunders et al |
Polyfiltronics Ltd. |
在英国的新公司负责滤芯微板 |
1987/1988 |
Dr. V. Matkovich |
Pall Corp. |
开发3层 96孔微板 |
1988 |
CoSar研发团队 |
CoStar |
引进8孔滤芯微板条 |
1988 |
Barry Bochner |
Biolog |
首个邮票大小的微板 |
1990 |
Roy Manns et al |
Polyfiltronics / Packard |
首款96孔透明底微板 |
1990 |
Tom Astle |
TomTech / Pfizer |
带有Porex滤柱筛的24孔微板 |
1991 |
未知 |
Helix |
首款864孔微板 |
1991 |
Richard Goodwin |
Neuroprobe |
首款具有细胞趋化分析腔的96孔微板 |
1991 |
Roy Manns |
Polyfiltronics |
首款玻璃纤维材料的微板 |
1992 |
Dr. G. Lennon et al |
Lawrence Livermore |
开发首款384孔微板 |
1992 |
Dr. Bochner et al |
Biolog / Polyfiltronics |
首款具有35mm玻片形式的48孔细胞培养微板 |
1992 |
Genetix研发团队 |
Genetix |
第一款商业化384孔微板 |
1992 |
Roy Manns et al |
Packard Instruments |
96和24闪烁计数滤微板 |
1992 |
Richard Goodwin |
Nueroprobe |
具有可视滤膜的趋化分析腔微板 |
1992 |
Roy Manns et al |
Pakard Instruments |
底部发光分析96孔微板 |
1993 |
Millipore研发团队 |
Millipore |
MultiScreen96孔PVDF滤膜微板 |
1994 |
Richard Goodwin |
Nueroprobe |
首款25ul低孔板和滤框ChemoTX系统 |
1995 |
Roy Manns/Dr. Seed |
Polyfiltronics / AGTC |
首款DNA深孔滤芯微板 |
1994 |
Roy Manns et al |
Polyfiltronics |
首款注模PCR微板 |
1995 |
Manns / Margolin et al |
Polyfiltronics |
首款注模384孔PCR微板 |
1996 |
Manns / Young et al |
Whatman |
首款1536孔微板 |
1995/1996 |
Manns et al |
Polyfiltronics / MDC |
首款96孔紫外透过微板 |
1996 |
Manns et al |
Whatman / Aurora |
首款3456孔纳米微板 |
1997 |
Dr. Knebel |
Greiner Labs |
首款注模1536孔微板 |
1997 |
Richard Goodwin |
Nueroprobe |
300ul ChemoTX系统 |
1997 |
Manns et al |
Evotec / Whatman |
首款96孔玻璃底微板 |
1997 |
Dr. K. Oldenburg |
Du Pont |
首款9600孔微板 |
1997 |
Dr. Knebel |
Greiner Labs |
首款方孔1536孔微板 |
1997 |
Genetix 研发团队 |
Genetix Ltd |
首款圆孔1536孔微板 |
1997 |
Lipsky, Manns |
Whatman |
首次2mm 玻璃/PP-组合化学 |
1997 |
Dr. Knebel |
Greiner Labs |
首款透明底1536孔微板 |
1997 |
Dr. Knebel |
Greiner Labs |
首款小体积(20ul)96孔微板 |
1998 |
Polyteam |
Whatman Group |
首款深孔(400ul)384孔微板 |
1998 |
Dr. Knebel |
Greiner labs |
紫外透过384孔微板 |
1998 |
Dr. Smith et al |
Whatman |
装载树脂的生物分析板 |
1998 |
内部研发团队 |
Affymax / Whatman |
首款864方孔微板 |
1998 |
内部研发团队 |
Affymax / Packard/ Whatman |
首款864孔可视滤膜微板 |
1999 |
内部研发团队 |
CoStar |
96孔滤芯微板 |
1999 |
内部研发团队 |
Millipore |
一体化96孔滤芯微板 |
1999 |
内部研发团队 |
Whatman / Polyfiltronics |
首款48孔5ml矩形微板 |
2.微板的SBS标准化 毫无疑问,微板作为一种开放的分析器皿,应用在实验的各个处理过程,如加样、混合、孵育、离心、洗板以及读数,标准化是统领各种处理的核心。感谢生物分子筛查学会(Society for Biomolecular Screening, SBS)于1996年在瑞士巴塞尔发布了微板的标准定义,1999年完整定义了微板全部几何尺寸。2003年提交给美国国家标准化组织(ANSI),ANSI于2004年颁布了包括96孔、384孔及1536孔微板标准(ANSI/SLAS 1-2004 至 ANSI/SLAS 4-2004)。微板标准(SBS)的制定,极大的促进微板以及相应的外围部件和设备的通用性和开放性的进一步开发,以便人们更好的利用微板开发ELISA试剂。 3.反应体系微量化 在过去的很长时间里,96孔微板在ELISA、CLIA、NAAT领域中被广泛使用。由于96孔微板有限的孔数量,迫使试剂研发者将多种蛋白组合在一个孔中,这样导致其灵敏度和特异性的下降且不能把多种蛋白真实性完全表现出来,这已成为公认的事实。近年来,人们正在384孔和1536孔微板上寻求大的突破。 由表3可见,高密度孔微板随着孔密度的增加,除了因微量化(miniaturization)可以更多减少试剂使用量而减少试剂的成本外(见表4),还可以大大缩短孵育时间以提高效率。高密度孔微板分析微量化有着诱人的前景(见表5)。越来越多的研究发现,高密度孔微板分析(如384或1536孔微板)的微量化,不仅能够获取同目前常用的96孔微板分析一样的精密性,并且能够明显提高分析的灵敏度[16][17][18]。 表3 三种不同微板在正常气压蒸发条件下工作时,其固相反应性能的比较
|
1536孔-微板 |
384孔-微板 |
96孔-微板 |
典型反应体积 |
6.00 ul |
25.00 ul |
100.00 ul |
反应表面积 |
17.79 mm² |
41.76 mm2 |
94.00 mm2 |
抗原-抗体复合物浓度[Ag-Ab] |
4.71 keq[Ag][Ab] |
2.65 keq[Ag][Ab] |
1.00 keq[Ag][Ab] |
扩散距离(X) |
0.80mm |
1.70mm |
3.50mm |
扩散时间(X2= Ddif•t) |
0.66/Ddif |
2.89/Ddif |
12.25/Ddif |
孵育时间 |
4.00min |
14.00min |
60.00min |
表4:基于96-孔微板ELISA试剂盒 VS. 基于384-孔微板ELISA试剂盒成本分析
所需成分 |
单价 |
成本/ 4 X 96孔-微板 |
成本/384孔-微板 |
反应体系 100ul |
反应体系 50ul |
微板 |
€0.97/96孔-微板 € 2.44/384孔-微板 |
€ 3.38 |
€ 2.44 |
捕获抗体 |
€330.00/ 500 µg |
€ 50.68 |
€ 25.34 |
封闭蛋白 |
€345.00/50 µg |
€ 0.48 |
€ 0.24 |
检测抗体 |
€425.00/50 µg |
€ 97.92 |
€ 48.96 |
封闭血清 |
€49.00/25 ml |
€ 1.52 |
€ 0.76 |
SA-HRP |
€250.00 per 1 ml |
€ 48.00 |
€ 24.00 |
TMB底物 |
€49.00 per 100 ml |
€ 18.80 |
€ 9.40 |
封板膜 |
€49.00 per 100 pieces |
€ 1.96 |
€ 0.98 |
终止液 |
€13.55 per 1L |
€ 0.76 |
€ 0.38 |
合计 |
€ 223.50 |
€ 112.50 |
表5 微板分析微量化的优势
优势 |
结果 |
减少反应体系 |
减少了昂贵试剂、生物样本和一次性耗材的用量 更少的产生生物和化学有害废弃物 |
提高分析性能 |
显著提高检测标的物的分析灵敏度 |
快速试验过程 |
在384孔或1536孔微板的孔中有更快的扩散速度 明显减少每个孵育步骤的孵育时间 |
高通量处理 |
384-孔微板 或 1536-孔微板反应模式是96孔微板的4或16倍 提高实验室处理的效率不仅仅是4或16倍 |
根据HTStec公司2012年调查报告(见图8),有57%的用户认为96孔微板分析可以满足需要,但另有43%的用户需要更微量化分析试剂,寻求384孔或1536孔等微量格式板。除了微板外,人们还试图采用微流体microfluidic来实现微量化。 图8 HTStec公司2012年关于ELISA试剂盒微量化需求的调查报告 4.微板包被系统: 在国内体外诊断试剂不断发展的二十多年间,人们也从早期仅关注试剂产业的变化、技术的进步、政策法规等,逐步发展到对试剂生产的质量控制的重视。包被了特异性蛋白的微板作为ELISA试剂中的特异性捕获固相载体,可靠的微板分析的第一步也是关键的一步是正确的将蛋白(抗原或者抗体)包被到微板上。微板包被,主要处理包括:包被-孵育-洗涤-封闭-干燥(见图9)。作为影响ELISA试剂质量关键之一的微板包被系统,也逐渐引起了行业内的关注。 图9微板包被流程 2005年,北京拓普公司推出第一台国产微板包被机,其采用96针加液头,但加液精度CV值仅为3%~4%,功能也仅仅是能够完成微板的包被液处理。2009年,该公司在国内市场推出第二代W369大型洗板封闭一体化包被机,将洗板封闭两工序合并,适用于大批量生产过程中的自动加液、自动洗板、自动封闭处理。到2012年,又成功推出了第三代微板包被机,增加了自动装载与自动存放微板的功能,孔间加液CV值不超过2%。这类型的国产包被系统,仅仅能够自动处理微板的“包被”、“洗涤”和“封闭”,并没有集成在线的孵育和干燥模块,从这个意义上讲这种自动包被机的应用仍处于“半自动”的微板包被模式。 目前,大部分ELISA试剂生产商都是采用半自动化的模式(有的甚至采用基于洗板机注液模式)进行微板的包被生产(见图10),由于采用分液精确度不高的洗板机或液体工作站及这种批量化的处理模式,容易存在人为的误差,导致包被的微板“孔-孔”、“板-板”、“批-批”之间存在明显的差异,影响了蛋白特异性检测的分析性能。采用这种“半自动化或手工”模式包被的微板ELISA试剂,其CV%变化非常大。目前很多国产的血筛试剂的“批一批”CV%在10-15%[14],有的甚至CV> 15%[10],这与采用的微板包被模式有一定的关系。 良好的制造规范(Good Manufacturing Practice, GMP)是ELISA试剂质量保证的基础,得益于自动化技术的发展以及新的液体工作站不断提高加样精度,市场上逐渐出现了集成的自动化包被系统。主要有德国OPTIMA的ImmuCoatR生产线(图11)等。这些自动化的微板包被系统,集成了高精度加样的液体工作站(或分配/吸液模块)、多通道洗板模块、孵育模块、喷码模块、微板传递模块等,实现了微板包被的自动化,消除了人为的误差。采用这种“批量自动化微板包被系统”包被的微板ELISA试剂,能够非常好的将“孔-孔”CV值控制在5%, “板-板”、“批-批”的CV值控制在在5-10%。 随着新技术的不断发展,以蛋白的特异性检测为ELISA试剂已经发展到超灵敏度和超特异性的新世代。而其中材料改性技术和表面修饰技术等相关技术的发展,为ELISA试剂提供了高绑定蛋白能力的固相载体平台[8][11][12][13],以此为基础的ELISA分析,其检测限甚至达到了pg级的水平[9]。这就对微板包被系统提出了新的挑战-更低的“孔-孔”、“板-板”、“批-批”的CV值。这就要求微板包被系统除提高加样的精度及消除人为误差外,还需改变“多板”处理的“批量”生产模式至“单板”处理的“连续”生产模式。烟台澳斯邦AusCoating Line是世界上第一条把生产模式改“批量“为“连续”的全自动微板包被生产线,从而实现了每块微板包被全过程完全一致(图12)。除此之外,AusCoating Line通过识别每块微板唯一的条码实现了从上载到包被全处理过程的追踪记录,确保了完整的溯源“证据链”,是目前唯一的满足良好生产规范(Good Automated Manufacturing Practice,GAMP)的完全全自动化的微板包被系统。结合独有的“封闭式环境控制系统”,实现了生产过程中最大化的一致性和可重复性、极致的孔间加液精密度达到CV<1%(50-1000ul)。 表6 目前已有的自动化包被生产线对比
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AusCoating Line |
ImmuCoatR Production Line |
M10-D1+2 |
处理模式 |
单个处理 |
单个处理+批次处理 |
单个处理+批次处理 |
每块板完全一致的处理步骤 |
每块板不是完全一致的处理 |
每块板不是完全一致的处理 |
液体处理 |
96头 |
8 /96针 |
8/16/96针 |
一次性加样尖 |
管路系统 |
管路系统 |
不同的包被批次, 只需更换加样尖 |
不同的包被批次, 需彻底的清洗管路 |
不同的包被批次, 需彻底的清洗管路 |
微板传递 |
Rack Runner轨道 |
传送带 |
传送带 |
洗板单元 |
AusWasher 无接触洗板 |
96 头洗板机 |
96 头洗板机 |
无洗板机堵针的现象 不同批次间,无需清洗管路 更适合自动化生产 |
接触性洗板 不同批次需清洗管路以避免交叉污染 |
接触性洗板 不同批次需清洗管路以避免交叉污染 |
孵育单元 |
在线的孵育架 |
在线的孵育器 |
在线的孵育器 |
单个板处理 |
批次处理 |
批次处理 |
每块板孵育时间和条件一致 |
每块板不是完全一致孵育时间 |
每块板不是完全一致孵育时间 |
带盖孵育 |
无盖孵育 |
无盖孵育 |
干燥 |
AusDryer |
风导干燥箱 |
传统干燥箱 |
将蛋白损伤降到最低 |
更高的蛋白损伤 |
更高的蛋白损伤 |
参考文献 [1].Goldberg, Richard J. (1952). "A Theory of Antibody—Antigen Reactions. I. Theory for Reactions of Multivalent Antigen with Bivalent and Univalent Antibody". J. Am. Chem. Soc. 74: 5715-25. [2].Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. Clin Invest 1960; 39:1157–75. [3].Ekins RP. The estimation of thyroxine in human plasma by an electrophoretic technique. Clin Chim Acta 1960; 5: 453–9. [4].Wide L, Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies. Biochem Biophys Acta 1966;30: 257–60 [5].Lequin, R. M. (2005). "Enzyme Immunoassay (ELISA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)". Clinical Chemistry 51 (12): 2415–8 [6].Bauke K. van Weemen, Clin Chem. 2005; 51(12)2226 The Rise of ELISA-ELISA [7].Carlson, Bruce (15 February 2014). "Seizing Immunoassay Opportunities". Gen. Eng. Biotechnol. News 34 (4). pp. 12–13 [8].Pipota J, Placek V, Vacek K, et al. Applied Bioactive Polymeric Materials. 1993; 42(4): 949-955 [9].Halim ND, Joseph AW, Lipska BK. A novel ELISA using PVDF microplates. J Neurosci Methods 2005 30 143(2)163-8 [10].杨晨曦,李宗生. 国产抗-HIV酶免双抗原夹心法试剂在血液检测中质量分析. 检验医学. 2004; 19 (3): 274-5 [11].Guruvenketa S, Mohan Rao G. Plasma surface modification of polystyrene and polyethylene. Applied Surface Science. 2004; 236: 278–284 [12].冯波,曾虹燕,唐裕芳,王 鲁. 60Co辐照聚苯乙烯微孔板在抗−HCV ELISA中的应用. 辐射研究与辐射工艺学报. 2005;23(6): 321-4 [13].Feng Y, Ning B, Su P, Wang H, Wang C, Chen F, Gao Z. An immunoassay for bisphenol A based on direct hapten conjugation to the polystyrene surface of microtiter plates. Talanta, 2009; 80(2): 803 [14].刘海波,王丽. 第四代HIV酶免检测试剂的应用与分析. 中国输血杂志, 2012; (S1):76 [15].Roy Manns, 2nd Edition May 1999,Microplate History, Presented at MipTec-ICAR’99, May 17 – 21, 1999, Montreux, Switzerland [16].Wu TL, Sun YC, Chang PY, Tsao KC, Sun CF, Wu JT. Establishment of ELISA on 384-well microplate for AFP, CEA, CA 19-9, CA 15-3, CA 125, and PSA-ACT: higher sensitivity and lower reagent cost. J Clin Lab Anal. 2003; 17:241–246 [17].Spies P, Mueller R, Chen GJ, Gygax D. A simple approach to improve the sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay: using the IMAPlate 5RC96 for result readout. Anal Biochem. 2010; 397: 48–52 [18].JANZEN, B., and DOMANICO, P. The 384-well plate: Pros and cons. J. Biomol. Screening. 1996; 2: 63- 64. (未完待续...) |