Title:Improve and enhance your proteome coverage with the Performance column for our long methods Journal:Evosep Application note Date:2022.04 Abstract: The Evosep Performance Column product line offer improved peptide identification rates. The 30 samples per day method and the Extended method is supported by, the matched performance column (EV1137) featuring a 15 cm column with an inner diameter of 150 μm packed with 1.5 μm C18 beads, increasing the separation efficiency over the corresponding Edurance column (EV1106). The smaller beads lead to a higher backpressure and it is therefore needed to maintain a column temperature of 40 degrees C to ensure a reasonable backpressure during the high flow equilibration phase, whereas the Endurance column is operated at ambient temperature (~22 degrees C). 研究方法: HeLa 酶解肽段是从Pierce购买的,加载在Evotip Pure上。使用标准方法在timsTOF Pro 2质谱仪(Bruker)上以DDA PASEF模式分析样品。使用30 SPD方法进行梯度分析,质谱参数循环时间为0.5秒,而扩展方法15SPD的循环时间为1.1秒。做五次重复。使用耐力柱(22 C°)和具有30 SPD和扩展方法15SPD的性能柱(40 C°)和使用10μm的固定喷雾发射器ZDV (1865691)。采用MaxQuant软件2.0.1版分析原始数据,标准设置为LFQ比率计数为1,启用“Match between runs”功能。 研究结果: 1.色谱性能的提升 通过使用更小粒径的填料改善了色谱峰宽,并且该峰的高度成比例地增加,这具有更高的灵敏度。随着性能柱的改变,峰宽显著降低。如下面的提取离子色谱图示例所示,在30 SPD方法下使用两种色谱柱分析BSA消化物(Figure 2)。 性能柱的半峰宽是4.5秒,比耐用柱的半峰宽窄45%。梯度的分辨率可以通过其峰值容量来计算。因此,峰容量就是在给定梯度时间内可以分离的理论峰数。由于峰容量与峰宽成反比,30 SPD方法的峰容量增加了80%。
2. 鉴定量的提升 性能色谱柱由于使用了粒径较小的填料,需要在40C°下加热,以保持适当的压力。因此,30 SPD和扩展方法15SPD在两种温度下均可进行有效的肽段分离。
研究人员使用30 SPD和扩展方法分析了Evotips上加载的400 ng HeLa肽,重复五份,从而对两种色谱柱进行了比较。对于30 SPD方法,使用两种方法的色谱柱观察4200和5200种蛋白质,使用性能色谱柱的蛋白质组覆盖率相对多鉴定了33%的多肽和21%的蛋白。通过对梯度长度为88min的扩展方法进行分析,也印证了这一点。同样,与耐用柱相比,性能柱鉴定到超过30000个肽段,相对提高了近30%。
研究结论: 性能色谱柱(EV1137)可用于30 SPD和扩展方法,并装有1.5μm C18磁珠。这将峰宽减少了近50%,同时峰容量增加。因此,蛋白质组的覆盖范围扩大了,利用Evosep One和Bruker tims TOF pro联用,在DDA PASEF模式下30 SPD方法鉴定到5000种蛋白质,扩展方法鉴定到6000种蛋白质。这些鉴定识别依赖于用于分析的软件。研究团队使用MaxQuant进行分析,同时也意识到其他软件工具可以提供不同数量的鉴定。此处描述的性能色谱柱适用于我们的长梯度的方法,有最佳的峰值性能和最大的蛋白质组覆盖率。(生物网 www.mamobio.com) 参考文献: 1. Bache N., Geyer PE., Bekker-Jensen DB., Hoerning O., Falkenby L., Treit PV., Doll S., Paron I., Müller JB., Meier F., Olsen JV., Vorm O., Mann M. (2018) A novel LC system embeds analytes in preformed gradients for rapid, ultra-robust proteomics. Mol Cell Proteomics., mcp.TIR118.000853. 2. Improve and enhance your proteome coverage with the Performance column for our long methods. https://www.evosep.com/wp-content/uploads/2022/06/AN-014A-Performance- |