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石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度 1.烤片: 将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr; 2.脱蜡: 切片放入盛有二甲-苯的容器中脱蜡3次(即二甲-苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min; 3.水化: 切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2 min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min; 4.抗原修复: 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗涤(2×2min)(具体修复方法见附1)* 注:有些抗原勿需修复,直接进入第5步封闭。 5.封闭: 滴加试剂B,37℃湿盒孵育30 min; 6.加一抗:滴加用试剂C(即用型一抗),37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜; 7.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min); 8.封闭: 滴加试剂B,37℃湿盒孵育10 min; 9.加二抗: 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂D),37℃湿盒中孵育30 min; 10.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min); 11.封闭: 滴加试剂Tween 20,37℃湿盒孵育封闭20 min; 12.加HRP-SA: 滴加用抗体稀释液稀释的试剂E(1:50~200,终浓度5~20 nM),37℃湿盒中孵育30 min; 13.洗涤: TBS-T洗涤(3×5 min),TBS洗涤(2×5 min); 14.显色:应用DAB溶液(试剂F)显色; 15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明; 16.封片: 待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片; 17.观察成像: 显微镜下观察成像。 |