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基因克隆的意义: 基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因或者人工合成目的基因,将目的基因与载体的DNA拼接,使重组体分子导入受体细胞,筛选和进行无性繁殖。这个过程可以称为基因克隆(gene cloning)。 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术,可概括为∶分、切、连、转、选。最终目的在于通过相应技术手段,将目的基因导入寄主细胞,在宿主细胞内目的基因被大量的复制。 基因克隆的基本步骤 基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子.在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节 1.扩增目的基因,比如通过pcr的方法。 2 pcr扩增的序列可以通过酶切或者topo ta的方法插入到载体质粒。 3转染大肠杆菌 4.筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物。如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的。 5.挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒。 |