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1、基本原理 CCK-8 细胞活力检测试剂盒含有 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)(CAS:193149-74-5),在电子载体存在的情况下 WST-8 被细胞内脱氢酶氧化还原后生成水溶性的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中,生成的甲臜量与活细胞数量成正比。CCK-8 法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法,可替代传统的 MTT 法。 图 1. WST-8 反应原理图
图 2. CCK-8 检测细胞活性原理图
2、产品用途 CCK-8 法应用非常广泛,主要用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验、活细胞计数、细胞活力检测以及生物因子的活性检测等。 3、各种细胞增殖/毒性检测方法的比较表 1. 细胞增殖/毒性检测方法的比较
4、CCK-8 的实验方法与步骤 应用场景一:细胞活性检测 1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96 孔板每孔加入 100ul, 使待测细胞密度为 1,000~10,000 细胞/孔。 2. 5% CO2,37℃ 培养细胞 24 小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整)。 3. 每孔加入10ul CCK-8 溶液。如果起始的培养体积 200ul,则需加入 20ul CCK-8 溶液,其它情况以此类推。 4. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时,对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的 CCK- 8 反应时间或增加细胞数量 (~ 105 细胞/孔)。悬浮细胞较贴壁细胞难显色。对于悬浮细胞,在加入 CCK- 8 孵育 1~4 小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定 CCK- 8 最佳孵育时间。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞,CCK- 8 的孵育时间一般为 1~4 小时,多数细胞培养 30 分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应,培养 3.5~4 小时左右检测效果最佳。 5. 酶标仪于 450nm 测定每孔吸光度。 应用场景二: 细胞增殖-毒性检测 1. 收集对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度,96 孔板每孔加入 100ul, 使待测细胞密度为 1,000~10,000 细胞/孔。 2. 5% CO2,37℃ 培养细胞 24 小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少进行调整)。 3. 加入 10ul 不同浓度的待测物质,将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如 6、12、24 或 48 小时或 72 小时等,根据待测物质的活性调整孵育 时间)。 4. 每孔加入 10ul CCK-8 溶液。如果起始的培养体积 200ul,则需加入 20ul CCK-8 溶液,其它情况以此类推。 5. 在细胞培养箱内继续孵育 0.5~4 小时,对于大多数情况孵育 1 小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的 CCK-8 反应时间或增加细胞数量 (~105 个细胞/孔)。悬浮细胞较贴壁细胞难显色。对于悬浮细胞,在加入 CCK-8 孵育 1~4 小时后,可先从培养箱中取出,目测染色程度或用酶标仪测定决定 CCK- 8 最佳孵育时间。若显色困难,可将培养板放回培养箱,继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞,CCK- 8 的孵育时间一般为 1~4 小时,多数细胞在培养 30 分钟左右即可肉眼观察到明显的显色反应,培养 3.5~4 小时左右检测效果最佳。 6. 酶标仪于 450nm 测定每孔吸光度。 图 3. CCK-8 检测实验操作示意图 测定吸光度值(OD 值)时的特别提醒: 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,如果待检测体系中存在较多的还原剂,例如一些抗氧化剂则会干扰检测,需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。 如何判定待测溶液是否有还原性?不含细胞的待测溶液孔中加入 CCK-8 溶液 10μl,孵育 1-4 小时,测定在 450 nm 处的空白吸光度。如果该吸光度值很小,说明待检测体系中存在较少的还原剂,正式检测时即可直接加入 CCK-8;如果该吸光度相对较大,说明待检测体系中存在较多的还原剂,正式检测时则需要除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基和 10ul CCK-8 进行检测。 计算公式: 细胞存活率 = [(实验孔 — 空白孔)/ (对照孔 — 空白孔)] × 100% 抑制率 = [(对照孔 — 实验孔) / (对照孔 — 空白孔)] × 100% 实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质) 对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8,不含有待测物质) 空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基,含有 CCK-8) 注意事项: 1. 第一次做实验时,建议先做几个孔摸索接种合适的细胞数量和加入 CCK-8 试剂后合适的培养时间。 2. 接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不一致。 3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发,为减少误差,建议培养板周围的四边每孔只加培养基。 4. 建议采用多通道移液器,减少平行孔间的误差,加 CCK-8 时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,干扰 OD 值。 5. 若细胞培养时间较长,培养基颜色或 pH 发生变化,建议更换培养基后再加 CCK-8,含有酚红的培养基不影响测定。 6. CCK-8 对细胞的毒性非常低,其他的实验,例如中性红法或结晶紫法,也可在 CCK-8 法检测完后继续进行。 7. 可以使用大于 600 nm 的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定,CCK-8 在参比波长处没有吸光值,设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。 8. 如果实验中待测物质有氧化还原剂,在不含细胞的培养基中加入药物,然后加入 CCK-8 试剂在一定时间内检测,和不加药物的培养基进行比较(只加 CCK-8 试剂),如果 OD 值明显偏高,则说明有反应,正式检测时则需要除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基和 10ul CCK-8 进行检测。 9. 加 CCK-8 试剂时速度要快,减少试剂在移液器上的残留,加入 CCK-8 试剂后轻轻震培养板,为了避免加样时由于 CCK-8 残留在枪头上所带来的误差,可以在加样前用培养稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。 10. CCK-8 反复冻融会增加背景值,干扰实验测定。 起底恩晶生物 EnoGeneCell™ Counting Kit-8 (CCK-8) 细胞活力检测试剂盒 市场上销售的 CCK-8 试剂盒的组成基本上是由 WST-8 和电子耦合剂按照一定的比例配制而成。WST-8 是南京恩晶生物通过系列工艺优化自主合成的,纯度在 99% 以上,超过了目前市面上多数试剂盒中 WST-8 的纯度,电子耦合剂则采用进口原料,这两者的高标准品质保证了恩晶生物 CCK-8 试剂盒的高质量,再加上恩晶生物的技术人员对试剂盒中的稳定剂、增敏剂、反应体系进行了全面的优化,质检人员对每个批次的试剂盒进行严格的质量检查,从而确保了恩晶生物的 CCK-8 试剂盒的高品质。 图 4. WST-8 的核磁共振图谱 图 5. WST-8 的质谱图谱 图 6. 恩晶生物与其他品牌 CCK-8 细胞活性检测结果对比 图 7. 恩晶生物与其他品牌 CCK-8 细胞毒性检测结果对比 超强稳定性 同一批次的 CCK-8 在 4℃ 和 37℃ 条件下存放,依次 0,7,14,21,28,35 天进行检测,并计算出 OD37℃/OD4℃ , 结果显示 CCK-8 在 37℃ 存放了 42 天的数值仅下降了 6% 恩晶生物 CCK-8 试剂盒的优点: ① CCK-8 法能快速检测; ② CCK-8 法对细胞毒性小; ③ CCK-8 法的重复性优于 MTT 法; ④ 水溶性,不需要换液,尤其适合于悬浮细胞; ⑤ 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂; ⑥ CCK-8 法的检测灵敏度很高,可以测定较低细胞密度; ⑦ CCK-8 细胞活性检测试剂中为 1 瓶溶液,毋需预制,即开即用。 ⑧ CCK-8 性价比高 CCK-8 法体外检测细胞增殖常见问题解答 Q: 一个孔中应接种多少个细胞? A: 当使用标准 96 孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 ul 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 ul培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验,请先 计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。 Q: 能否用 24 孔或者 384 孔板进行试验? A: 可以。向各孔中加入培养基体积 10% 的 CCK-8 溶液,如果加入的 CCK-8 体积太少,可以先将 CCK-8 溶液稀释 1 倍制成工作液,然后加入培养基体积 20% 的此工作液。 Q: CCK-8 能否检测细菌细胞? A: 可以检测 E.coli,但不能检测酵母细胞。向 100 ulE.coli 培养液中加入 10 ul CCK-8 溶液,并培养 1-4 个小时或过夜。 Q: 酚红会影响检测吗? A: 不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。 Q: CCK-8 与胸苷结合检测之间是否有相关性? A: 有。然而,请注意由于 CCK-8 使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。 Q: CCK-8 稳定吗? A: CCK-8 很稳定,在避光 0-5℃ 条件下至少可以保存 1 年。 Q: 如果没有 450 nm 的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片? A: 还可使用 450 nm 到 490 nm 之间的滤光片。 Q: 如何减少由于 CCK-8 试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差? A: 可以在加样前用培养基稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。 Q: CCK-8 能否对活细胞进行染色? A: 不能。因为 CCK-8 的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8),并通过电子载体将活细胞中的电子交换到培养基中的 WST8 上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的,因此 CCK-8 不能对细胞进行染色。 Q: CCK-8 检测溶液对细胞是否有毒? A: 加到培养基中的 CCK-8 是没有毒性的,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在 CCK-8 检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者 DNA 荧光检测等。由于每种细胞对于 CCK-8 的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入 CCK-8 培养后的活力。 Q: 在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决? A: 有时会有影响。如果药物具有还原性,会和 CCK-8 发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入 CCK-8,测定 450 nm 的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加 CCK-8 )的吸光度高,则证明药物有影响,可在加 CCK-8 之前更换培养基,去掉药物的影响。 Q: 每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决? A: 可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为 CCK-8 沾在壁上而产生误差,建议在加入 CCK-8 后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少,请预先在 1,000~100,000 个/孔范围内摸索条件。 Q: 如何设定空白对照? A: 在不含细胞的培养基中加入 CCK-8 ,培养一定的时间,测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入 CCK-8,培养一定 的时间,测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。 Q: 在加入 CCK-8 时可否不更换培养基? A: 一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有还原性物质的话,有可能会产生误差,必须更换其它培养基。 Q: 哪些物质会影响 CCK-8 的测定? A: 当有还原性物质存在时会影响 CCK-8 的测定,例如含有维生素 C 的 Glucose 等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。 Q: 在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决? A: 可以缩短加入 CCK-8 后的培养时间。例如:可以把加入 CCK-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。 Q: 在 CCK-8 显色过程中,如何终止反应? A: 有以下几种方法,以 96 孔板为例: 1、 在显色反应后,将培养板放置 4℃ 冰箱内。 2、 每孔加 10 ul 0.1 M HCL 溶液。 3、 每孔加 10 ul 1%(w/v)的 SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在 24 小时之内测定。 Q: 必须预培养细胞吗? A: 不一定。如果要想保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。 Q: 如果加入的药物中含有金属,是否会有影响? A: 金属对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的 lv 化亚铅、lv 铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90% 的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是 10 mM的话,将会 100% 抑制。 Q: CCK-8 试剂的保存条件? A: 在避光 0-5℃ 条件下可以保存 1 年。 Q: 预培养后,更换培养基需要细胞计数吗? A: 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。 Q: CCK-8 对于不同的细胞,灵敏度是否一样? A: 不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入 CCK-8 培养 1-4 小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长 CCK-8 的加入时间或增加细胞数量来解决。 Q: 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别? A: 悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。 Q: 应该每次做标准曲线吗? A: 建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。 Q: 有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量? A: 不能。由于 CCK-8 是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。 Q: 实验之前,是否需要先检测一下培养基和 CCK-8 是否会反应? A: 建议使用一个孔作一下检测,因为有的培养基可能含有还原性物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和 CCK-8 是否有反应。一般正常培养基的 OD 值应该在 0.4 以下。 |