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急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原核酸检测试剂盒(一管式恒温荧光法) ◆ 产品说明 动物疫病检测系列基于独特的恒温荧光检测技术,可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸片段进行扩增,通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原的检测,检出限为103copies/μl基因组DNA。 ◆ 产品组成(48测试)
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒温荧光检测仪,ABI 7500,LightCycler480,CFX 96等荧光PCR仪。 ◆自备耗材和仪器 ①灭菌1.5mL或2.0mL离心管;②冰盒;③移液器(0.1-2.5μL,0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL)及配套灭菌吸头;④离心机;⑤涡旋混匀器;⑥金属浴 ◆注意事项 1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。 1)第一区:样本制备区。 2)第二区:模板添加区。 3)第三区:扩增及产物分析区。 ★分区之间最好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。 2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。 3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。 4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心30秒。 5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。 6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。 ◆ 样品处理 参照相关标准处理样品,制备的样本保存待用。 详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。 ◆ 实验操作 1. 模板制备(样本制备区) 请参照水生动物病害基因组DNA快速提取试剂盒说明书的提取步骤。 2.添加模板(模板添加区,放置于冰盒中进行) 取出所需测试数的已含有反应液的PCR管,将试剂完全解冻,解冻后打开管盖向各管管底分别加入1μL B-I,盖上管盖离心1 min。打开管盖分别向各管管壁上加入2μL模板,顺序为NG-I、待测样品模板、PG-EMS-I。盖好PCR管盖后,离心3 min,立即进行PCR扩增反应。 3. 扩增反应(扩增及产物分析区) ①恒温仪器63℃条件下反应30 min。 ②若使用荧光定量PCR仪,则荧光基团选择FAM,淬灭基团选择None,将63℃ 15 s,63℃ 45 s作为一个循环,于63℃ 45 s处收集荧光信号,30个循环。 若使用其他仪器请参照仪器说明书进行设置。 ◆ 结果判定 ①恒温仪器自动判定结果,若显示“阳性”,则样品中含有急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原;若显示“阴性”,则样品中不含有急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原或含量低于检测限。如在20min~30min间出现曲线上扬而自动判读结果为阴性,可能由于样品含量较低导致,建议对样品进行富集或延长反应时间至45min进行复核。 ②在荧光定量PCR仪上,根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线,则样品中含有急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原;若无“S”型扩增曲线,则样品中不含有急性肝胰腺坏死病(AHPND/EMS)病原或含量低于检测限。
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