实验方法

慢病毒RNAi干扰

2013-11-04 10:42

(1)原理

慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性,作为基因治疗载体发展起来,最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比。

一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,lentivirus-shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。

(2)服务流程

1)含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取;

2)慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞;

3)培养48~72h,收集培养上清;

4)病毒的纯化和浓缩(超离和/或超滤);

5)滴度测定、目的基因检定

6)将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞,筛选混合稳定细胞株,并检测靶基因的表达。

客户提供

1)表达miRNA/shRNA的质粒(提供测序图谱)或所要Knockdown的靶基因的名称、序列;

2)所需要的病毒滴度及总量,病毒是否需要纯化

3)若需要检测靶基因的表达变化,如需要请提供相应的抗体

我们提供

1)提供重组后的慢病毒载体质粒

2)提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液

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来源:互联网

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