构建过表达载体克隆这一步就卡住了怎么办

你要先明确你的目的片段大小然后选择合适的载体质粒，和内切酶，具体哪一步有问题可以细致的问，实在不行提供基因给公司让公司合成

主要考虑克隆位点选择的问题。建议首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择

的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位

点。双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer

一致，双酶切效率高的两个内切酶。

一些建议:

1. 仔细复查克隆过程每一步,确保每一步操作准确无误。检查是否选对了载体,是否采用了正确的酶切位点等。

2. 查阅相关文献和实验方案,了解这一步可能遇到的问题及解决方法。比如是否需要改进转化效率,调整培养基成分等。

3. 修改实验方案,尝试使用其他载体或不同的克隆策略。有些情况下改变载体类型、使用不同的启动子等可以提高克隆效率。

1. 引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来

在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；

人基因ORF库购买。

2. PCR产物酶切不成功

构建克隆载体，再酶切；

载体自连会使Lac Z编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。

3. 没有合适的酶切位点

无缝克隆试剂盒。

4. 没有合适的抗体

加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；

引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；

载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。