普通免疫荧光可以验证自噬吗？

对,如果没有GFP-LC3转染,也可以直接用LC3抗体做免疫荧光来检测自噬。主要步骤是:

1. 固定细胞,一般用4%多聚甲醛固定10-20分钟。

2. perfor化,用0.1-0.5% Triton X-100处理,打开细胞膜的孔隙。

3. 封闭,用5-10%的羊血清或BSA封闭1小时,减少非特异性染色。

4. 一抗,加LC3抗体(1:200-1:500稀释),4°C过夜。

5. 二抗,加入标有荧光素的二抗( FITC或TRITC标记),室温孵育1-2小时。

6. DAPI染色核 DNA,呈现蓝色。

7. 荧光显微镜下观察,LC3为绿色或红色点状荧光信号。

8. 可选做quantitative analysis,计算荧光点数,代表自噬小体的数量。

所以没有GFP-LC3,也可以通过抗体直接检测内源性LC3的点状荧光,评价自噬水平。需要优化每一步的条件,确保结果可靠。

可以直接用LC3抗体做普通免疫荧光，建议将LC3固定一下，这样可以防止降解。

LC3 抗体可应用于酶联免疫吸附测定, 免疫荧光, 免疫组化, 蛋白质印迹, 其他等领域。