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        cck8实验,测OD值前更换培养液(原培养液中有还原性物质),需要用PBS清洗几次?怎么轻缓冲洗?

        user-title

        棒打鲜橙girl

        做脂肪细胞,测三天增殖,初始接种量为2000cells/孔,可以嘛?

        wx-share
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        3 个回答

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        用pbs洗一次即可,加入pbs后挺轻晃动培养板就行

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        检测步骤:


        1. 细胞计数


        对消化下来的细胞悬液进行细胞计数,一般计数2-3次取平均。


        2. 细胞铺板


        根据 预接种细胞数量+ 细胞计数结果调整细胞浓度,铺96孔板(加样均匀),每孔100μL,将铺好细胞(对数期)的96孔板放入37℃培养箱培养。


        铺板注意事项:


        (1) 铺板要混匀:


        a) 可以先往孔里加50μL培养基,再接种50μL细胞悬液;


        b) 不时地混匀细胞悬液,以避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接种几个孔就混匀一下;


        c) 铺完板后,还可以轻敲板底,帮助细胞分散均匀。或者用振荡器摇板帮助细胞分散。


        (2) 有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数


        (3) 每次测定都需要在同一块板上设置调零孔。


        (4) 培养板周围一圈孔容易蒸发,为了减少误差,培养板的四周只加无菌PBS,而不作为指标检测孔。


        (5) 加液时,枪尖贴着孔内壁慢慢加,避免出现气泡,它们会影响OD值的读数。


        3. 细胞处理


        4-6h后观察到细胞贴壁后(细胞系快,原代慢),开始造模+操作分子+治疗药物等相应处理。


        4、加入CCK-8


        有三种做法:


        (1) 直接往培养液加入10μL的CCK-8;


        (2) 吸掉旧培养液,不加PBS清洗,再加入新配好的CCK-8;


        (3) 吸掉旧培养液,PBS洗一遍,再加入新配好的CCK-8。


        推荐做法:处理完毕后到达0、1、2、3、4、5天,吸掉旧培养液,每孔加入10μL CCK-8+100μL培养基(按每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液,配mix混合液,多配一孔,不要有气泡),继续培养2.5-3h左右。


        5. 酶标仪检测


        6.数据处理

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        初始细胞2000是可以的,需要用pbs洗至少三次

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