裂解组织

RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，

加足5ml RIPA缓冲液，研磨20min.

蛋白浓度低可能是原始细胞不足，可以多加一些细胞，然后适当延长裂解时间

可以按以下几点操作进行:

1. 按需处理细胞。

2. 平板用 PBS 洗涤，以去除残留的培养基。

3. 每个 10 cm 的培养皿添加 400 µl 1x RIPA 缓冲液。

4. 平板放在冰上孵育 5 分钟。

5. 刮取细胞。

6. 超声短暂处理。

7. 提取物用冷微量离心机以 14,000 x g 的离心力离心分离 10 分钟。

8. 取上清液后使用。

9. 对于非黏附细胞，用 1X PBS 洗涤并进行沉淀后，每 107 个细胞添加 400 µl 缓冲液。

10. 1X RIPA Buffer 可用于裂解组织样品，尽管在添加裂解缓冲液后建议进入均化步骤。按照 100 mg 组织对应 1 ml 缓冲液的比例提取组织。组织提取物还需进行超声处理。

11. 其他蛋白酶抑制剂可添加到 1x 裂解缓冲液中。

12. 试剂抵达时，该缓冲液中可能会发生聚沉，因为提供的 10X 配制液中包含高浓度的试剂。有时，即便加热到室温，也会持续聚沉。我们建议将缓冲液加热到 37°C 15 分钟后混合，以消除沉淀。或用 ddH2O 将 10X RIPA 稀释为至少 5X 的溶液，以便获得不含沉淀物的溶液。一旦稀释，可进行分装并保存在 -20°C 下供日后使用。

以下是一些可能的改进策略：

1. 增加细胞数量：如果可能，尝试增加用于提取的细胞数量。更多的细胞通常会导致更高的蛋白浓度。

2. 优化裂解条件：确保充分裂解细胞。这可能包括更长时间的震荡或孵育，使用超声波处理，或增加裂解缓冲液的体积。

3. 使用蛋白酶抑制剂：在裂解缓冲液中添加鲜制的蛋白酶抑制剂，以防止蛋白质被分解。

4. 避免蛋白质沉淀：在离心和吸取上清液的过程中，小心操作以避免损失可能的蛋白质沉淀。

5. 选择更强力的裂解缓冲液：如果以上方法都不能提高蛋白浓度，可以尝试更强力的裂解缓冲液，如SDS裂解缓冲液。但请注意，这种强力的裂解缓冲液可能不适用于所有类型的后续实验，如免疫沉淀。

6. 蛋白浓缩：如果蛋白质浓度依然低，但又需要更高的蛋白浓度进行后续实验，可以考虑使用蛋白浓缩工具，如离心浓缩器或蛋白沉淀剂，来增加蛋白浓度。