跪求：鼠原代血管平滑肌细胞VSMC经验？

鼠原代血管平滑肌细胞

1）取材：颈椎脱臼处死小鼠，在75%乙醇中浸泡2min，用眼科剪镊依次打开胸、腹腔，暴露心脏；10mL注射器抽取无菌PBS约10mL，连接在1mL注射器针头上穿刺左心室，冲洗主动脉。完整分离主动脉，放入35mm平皿中，加入2mL PBS缓冲液。在体视显微镜下小心将血管周围的结缔组织去除，使用显微弹簧剪沿主动脉纵轴剪开动脉，用显微镊子小心分离动脉中膜层并移入另一个含有2mL含20%FBS的DMFM/F12培养液的35mm平皿中，迅速转移至超净台。用眼科剪将中膜剪成大小约1mm×1mm的组织块，备用。

2）组织块培养法：将组织块连同培养液一起移入6孔板中，小心吸出培养液，摇晃6孔板，使组织块分散分布于6孔板底，将细胞移入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中孵育6h，使组织块牢固贴附于培养孔底部后缓慢加入2mL含20%FBS的DMEM/F12培养液。放入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养，每3d换液一次，组织块周围爬出的细胞达到培养面积80%时（18~20d）进行传代。

3）胶原酶消化法：将剪碎的组织块移入到15mL离心管中，加入3mL消化液（7.5mgII型胶原酶溶于5mL含20%FBSDMEM/F12中），放入培养箱中消化6h，1200r/min离心5min，去掉上清，加入2mL含20%FBSDMEM/F12培养基，轻轻吹打分散细胞，接种于6孔板中，置于5%CO2，37℃饱和湿度培养箱内培养，当细胞生长至80%汇合度（7~10d）即可传代。

4）细胞的生长及传代：吸取并弃掉旧培养基，加入PBS磷酸缓冲液清洗细胞充分洗去残留的血清成分；6孔板每孔加入0.25%胰蛋白酶500μL，在37℃消化3min；倒置显微镜下观察到细胞收缩变圆时，立即加入含FBS的培养基终止消化，将细胞从培养板底冲洗下来，以1：3的比例传代至新的6孔板中。每2d换液1次，待细胞生长达到70%以上汇合度时再次传代。

5）小鼠主动脉平滑肌细胞鉴定：分别对2种方法分离的3代和8代细胞进行免疫荧光鉴定。待细胞处于指数生长期时，弃培养基，加入PBS缓冲液清洗3次，每孔加入1mL4%多聚甲醛，室温固定20min；PBS洗3次，加入0.25%TritonX-100室温透膜1h；PBS洗3次，加入含10%山羊血清PBS的封闭液室温封闭1h；PBS洗3次，加入羊抗鼠α-SMA一抗（1：200

嗯啊，整过，丁香实验里没有吗？取大鼠，称重，水合氯醛0。3ml/100g腹腔麻醉。绑好大鼠，先剪开腹腔，剪断腹部大动脉放血，后剪开胸腔，取肺。放入烧杯，后移入超净台，置于冰盒上。以后的操作皆在冰盒上操作。 倒入已加双抗的D-HANKS，清洗肺部，扯掉食管，剪掉心脏。用针头将肺固定在硅胶板上，硅胶板置于培养皿里。用镊子将肺的内外膜除去，只剩下平滑肌。眼科剪将肺部剪成1－2mm的小碎块。将碎块移入配好的消化液中，放入培养箱中，消化15min。取出，加入无血清的DMEM，约10ml，移入离心管中。980转/min，离心10min。 倒掉上清，加入约1ml含20％FBS的DMEm。将碎块用滴管加入25ml的培养瓶里，液体不要加多，有种湿湿的感觉即可。一到两天可以再加点液。