请问肾脏组织做流式细胞术样本怎么处理呀？怎样制成单细胞悬液？

选取合适的肾脏组织。选好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化组织的试管中。 常规消化20～30min（恒温37℃或室温），消化期间间断振荡或吹打。 终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞，低速离心除去细胞碎片。加入PBS2ml充分混匀，离心弃掉上清。再加入0.5mlPBS重悬细胞。将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。

1. 将肾脏组织转移⾄预冷的PBS缓冲液中。

2. 继续在冰上操作，将预冷的⼿术⼑⽚或剪⼑将肾脏组织切割成1 mm3左右的组织⼩块。

3. 将10 mg左右已切碎的肾组织放在培养⽫中，然后转移到1.5 mL试管中，加⼊1 mL混合酶液，混合酶液必须先放在冰上进⾏预冷。

4. 每1 min晃动⼀次试管，从第2分钟开始每3

分钟研磨10次。可将枪头前端⽤剪⼑剪成宽⼝枪头，移液枪调⾄700 µL。

5. 在冰上孵育30 min后，转移到冰上沉淀1 min。

6. 去除80 %左右体积的上清液，并将剩下的液体直接⽤30 µm的滤膜过滤，并⽤5 mL左右预冷的4 % PBS/BSA清洗过滤器。

7. 洗脱下来的液体（含有细胞）转移到15 mL⼤号离⼼管中，并同时添加预冷的0.04 % PBS/BSA⾄总体积为10 mL。

8. 冷冻离⼼机4℃，650 g离⼼5 min后，去除上清液，将细胞重悬于10 mL的4 % PBS/BSA，并置于冰上。

9. 向含有组织块的试管中添加额外的1 mL混合酶液。每3 min研磨10次，每分钟摇动⼀次，同时在冰上孵育。

10. 50 min后（总计1 h 20 min），将全部体积的消化混合液通过新的30 µm滤膜，过滤⾄50 mL的离⼼管中，⽤5 mL预冷的0.4 % PBS/BSA冲洗过滤1-2次。

11. 将液体转移⾄15 mL锥形管。⽤0.04 %预冷的PBS/BSA将体积调到10 mL。将此管和前⼀层的管（两个管）离⼼（650 g，5 min，4℃），去除上清液。

12. 如果组织含有⼤量的红细胞，需要加⼊美天旎裂红试剂盒（Miltenyi Red Blood Cell Lysis Solution，货号130-094-193）进⾏裂红操作，具体操作参照试剂盒说明。

13. 4℃，650 g离⼼5 min，去除上清，只留下100 µL体积。

14. 加⼊0.04 %预冷的PBS/BSA⾄10 mL，4℃下650 g离⼼5 min，尽可能多的去除上清。

15. 在冰上，⽤100 µL预冷的0.04 % PBS/BSA重悬细胞悬液，然后取适量悬液，采⽤台盼蓝或荧光计数法对细胞数量和活性进⾏检测。