Wb小白求助各位大佬 肠occludin

第一次做WB，大佬们求指点

目的蛋白，肠组织occludin，转膜300mA，1h，封闭2h，一抗孵育12h，二抗孵育2h，一抗稀释1：1000，内参1：2000，二抗稀释1：5000。一抗稀释用的5%脱脂奶TBST，二抗用的TBST孵育。

• 1、肠组织上清黄的正常吗？测出来浓度14ug/ul。难道我剪的时候要洗一下吗？里面有脂肪和粘液？到底怎么剪怎么处理合适呢。
• 2、如果目的蛋白条带这个是拖尾吗？还是别的？条带如果因为是蛋白降解，是因为提取过程中吗？我用的沸水煮，我是不是应该温度低点？或者超声产热导致的？
• 3、跑胶的时候，marker挺齐的，你们是转膜前就把目的内参切开了，就是切胶，还是转完膜切胶啊？我的目的和内参离得好近，不太好乱切，你们用的剪刀还是小刀，我的剪的好歪
• 4、封闭的时候你们1还是2小时，我用的2小时，是太久了吗？转速这时候应该快还是慢呢？我的摇床是左右像跷跷板那种，有用这种的吗，你们转速多少啊！！
• 5、一抗孵育，有的说室温晃半小时再4°静置过夜，过夜后再室温晃0.5h，回收一抗，有必要这两个室温0.5h吗？我用的5%奶tbdt稀释的，合适吗
• 6、二抗孵育，转速你们是多少啊，我孵育了两小时？太久吗？
• 7、显色液你们放在小盒子里吗！！我放小盒子配AB液的时候，用体积8ml都不够，你们怎么放的，一次10ml好浪费啊，我一瓶才12.5ml救命！！
• 8、显色的时候，你们放膜是在润饰的状态下放的吗，我有气泡！！！放的时候！！救命啊！！
• 9、曝光时间几秒和几分钟我都试了，我不知道怎么判断哪个时间是合适的，他们都有条带显示