WB泳道发黑，背景高

没有封闭好,但这个可能很小

一抗浓度太高,适当降低增加一抗稀释比例

二抗孵育时间太长,一般室温45min,二抗切不可孵育时间太长 背景太高,抗体浓度太大的原因。

考虑原因是，抗体浓度太高或者封闭时间不足

一般跟一抗有关系吧，背景高有几点原因：1.过量的抗体；2.不当的洗膜条件；3.抗体过时或受损；4.蛋白质降解；5.膜过于湿润；6.检测抗体非特异性结合。