求问，外泌体悬液如何提取蛋白呢？

差速离心法是根据不同蛋白质分子及囊泡、细胞及细胞碎片等在均匀悬液中沉降速度的差异,通过逐渐增加离心力或离心时间,分离沉淀或上清的方法来提取。一般先采用低速离心如1500×g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质,再高速离心如100000×g离心2h得到目的微球,然后用0.22μm的滤膜去除凋亡小体、微泡等进一步纯化。

外泌体悬液提取蛋白的方法有很多，其中超速离心法是一种常用的方法。以下是超速离心法提取外泌体蛋白的简要步骤：

1. 收集外泌体悬液：首先需要收集含有外泌体的细胞上清液或生物液体样本（如血液、尿液等）。

2. 离心分离：将收集到的外泌体悬液以适当的速度离心（如1000g，10分钟），以去除大的细胞碎片和颗粒。

3. 洗涤外泌体：将离心后的上清液再次以更高的速度离心（如10,000g，30分钟），以去除残留的蛋白质和其他细胞碎片。

4. 再次离心：将洗涤后的外泌体再次以更高的速度离心（如100,000g，1小时或更长时间）。这一步骤有助于进一步纯化外泌体，去除杂质。

5. 收集外泌体：在离心后的离心管底部，可以看到一层白色的沉淀物，这通常是外泌体。小心地将外泌体沉淀物收集到新的离心管中。

6. 蛋白提取：可以使用适当的缓冲液（如PBS）来重新悬浮外泌体沉淀物。随后，根据需要选择适当的蛋白提取方法，如超声波破碎、组织裂解液或蛋白酶处理等。

7. 蛋白定量和纯化：使用蛋白定量试剂盒（如BCA试剂盒）对提取的蛋白进行定量，并根据需要选择适当的纯化方法（如柱层析、凝胶电泳等）来进一步纯化蛋白。

但是，实际操作时可能需要根据外泌体的来源和特性来调整实验条件。

用离心的方法收集外泌体，根据外泌体的大小选择离心材料和离心条件。

我常用的是超滤法，根据外泌体的大小选择相应截留分子量的超滤膜，采用超滤技术，配合离心去除残余的细胞，然后进一步使用0.22μｍ滤膜过滤除去细胞碎片、大分子囊泡等，从而分离外泌体。

超滤法操作简单、省时、成本低，产量和效率也较高，但小于膜孔的非外泌体成分或灵活性好的混杂蛋白也可以通过滤膜，从而导致外泌体纯度不足。此外，外泌体可能会堵塞膜孔影响分离效率。