WB实验中，内参出现上下两个条带，是什么原因？

具体原因可能是该蛋白出现了同源二聚体，故都可以被抗体识别出来或者该蛋白有部分降解，但是未降解部分依然可以和抗体结合，另外抗体特异性不高，也会出现非特异性的结合，造成出现两条或者多条带，所以Western blot会出现两条带

loading buffer 有问题，二抗没必要孵育2小时，室温1小时就将可以。至于内参，一抗二抗室温各孵育30min都行

内参（参考蛋白）出现上下两个条带时，可能是由以下几个原因造成的：

1. 表达多个变异形式：内参蛋白可能存在多个变异形式，例如剪切异构体或翻译后修饰引起的不同形式。这些变异形式可能具有不同的分子量，导致上下两个条带的出现。

2. 翻译后修饰：内参蛋白可能受到翻译后修饰的影响，如磷酸化、糖基化或乙酰化等。这些修饰可以导致蛋白的分子量发生变化，从而产生上下两个条带。

3. 降解或裂解产物：内参蛋白可能被降解或裂解为多个片段，在Western Blot中显示为上下两个条带。

4. 蛋白交联：某些情况下，内参蛋白可能与其他蛋白发生交联，形成复合物或聚合物。这种交联可能导致蛋白复合物的分子量增加，从而产生上下两个条带。

考虑是你样本本身问题，极有可能是样本发生降解了。

解决办法有两个，一是优化蛋白提取流程，防止降解；二是选用针对N末端的抗体，比如Proteintech 66009-1-Ig。