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        coip的对照IP样品也有比较弱的目的条带怎么办?

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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        z流沙z


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        2 个回答

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        土井挞克树

        有帮助

        对照样品也有弱条带最大可能就是非特异性结合的原因,可以把对照ip的背景再封闭一遍避免非特异性结合或者更换特异度高的抗体重新跑

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        loveliufudan

        有帮助

        Co-IP实验中,对照IP样品(通常为非免疫(IgG)对照或不添加抗体对照)出现较弱的目的条带可能是非特异性结合或背景信号。为减少这种非特异性结合并改善实验结果,请尝试以下方法:

        清洗和预处理:确保充分清洗细胞裂解液和磁珠,以减少非特异性蛋白结合。预先用含有BSA或无抗原同源蛋白的缓冲液处理磁珠,以阻止非特异性结合位点。

        使用高质量抗体:确保使用特异性高且经过验证的抗体。低质量抗体可能导致非特异性结合和背景信号。如有可能,请使用针对您目的蛋白的经过验证的免疫沉淀抗体。

        增加对照组:除了常规对照外,还可以设置额外的对照组,例如使用非相关的抗体对照,以进一步评估非特异性结合。

        优化裂解和洗涤缓冲液:使用适当的洗涤次数和缓冲液成分以减少非特异性结合。尝试在裂解缓冲液和洗涤缓冲液中增加盐浓度(如0.5M NaCl),以降低非特异性结合。

        优化孵育时间和温度:减少抗体与磁珠的孵育时间(如 overnight 到 2-4小时),以降低非特异性结合的可能性。同时,可以在实验中尝试不同的孵育温度(4°C或室温)。

        降低抗体浓度:使用较低的抗体浓度可能有助于降低非特异性结合。尝试使用不同抗体浓度,同时关注特异性和非特异性结合之间的平衡。

        使用蛋白质酶抑制剂和泛素酶抑制剂:添加蛋白质酶抑制剂和泛素酶抑制剂以防止蛋白质降解,这可能导致非特异性结合。

        提高细胞裂解液的纯度:在进行实验前,请确保细胞裂解液的纯度较高,以减少非特异性蛋白结合的可能性。

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