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        基质金属蛋白酶WB求助

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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        姚垚垚垚

        有没有人跑出来MMP9的WB呀,可以分享一下过程和试剂吗,枯了这个太难跑了

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        3 个回答

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        此用户已注销

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        样品处理中使用的设备或缓冲液应在冰上(4 ℃)冷藏保存。尽可能使用预冷的试剂和设备,可以减缓去磷酸化、蛋白水解和变性。在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂,否则轻者条带不明显,重者没有条带。最好是添加新鲜配制的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混和物,蛋白定量后,将样品与上样缓冲液混合,遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在冰箱中或加载到凝胶上。

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        姚垚垚垚user-title

        提蛋白全程冰上进行的,用的不含EDTA的RIPA+蛋白酶磷酸酶抑制剂,样本也没有煮,用的是非变性非还原的loading,上样量20ug,制备8%的无SDS的胶,用无SDS的PAGE电泳,然后转膜1.5h,用的快速封闭液封闭的,abcam的抗体1:5000稀释过夜孵育,二抗是CST的,用商品化的抗体稀释液稀释的,中间都是洗膜三次,直接曝光的全膜,但是就是没有条带,干干净净一张白纸😭

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        灵枢天问

        有帮助

        如果很多次都跑不出来那最有可能出问题的就是抗体,抗体没选对

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        姚垚垚垚user-title

        提蛋白全程冰上进行的,用的不含EDTA的RIPA+蛋白酶磷酸酶抑制剂,样本也没有煮,用的是非变性非还原的loading,上样量20ug,制备8%的无SDS的胶,用无SDS的PAGE电泳,然后转膜1.5h,用的快速封闭液封闭的,abcam的抗体(货号ab76003)1:5000稀释过夜孵育,二抗是CST的,用商品化的抗体稀释液稀释的,中间都是洗膜三次,直接曝光的全膜,但是就是没有条带,干干净净一张白纸😭

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        bamboopiggy

        有帮助

        普通的wb跑法没有问题,但是我记得我用的抗体是abclonal的,你实在不行就跑个全膜看看,是不是位置有改变,你没有切到。

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        姚垚垚垚user-title

        我跑的是全膜,样本没有煮,用的是非变性非还原的loading,上样量20ug,制备8%的无SDS的胶,用无SDS的PAGE电泳,然后转膜1.5h,用的快速封闭液封闭的,abcam的抗体1:5000稀释过夜孵育,二抗是CST的,用商品化的抗体稀释液稀释的,中间都是洗膜三次,但是就是没有条带,干干净净一张白纸😭

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