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        求助|大家是怎么提组织样的总蛋白的?

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

        user-title

        小熊小熊心情好

        我要取棉铃虫的中肠,提组织总蛋白,跑WB。

        我的步骤是先将棉铃虫置于冰上麻醉,研磨仪的转子预先放在-20℃预冷,在EP管里加入400ulPBS\细胞裂解液(两个都试过),插入冰中,在取样前,再加入PMFS或者cocktail(两个都试过),取样的过程自认为也挺快的,取好样了就用研磨仪研磨2min,然后立马放到4℃离心机中8000rpm/min 5min,离心后立马加入蛋白上样缓冲液煮10min。

        但是就是这样还是取不出来,跑WB,actin都没有,老是降解。球球各位大佬,有什么经验或者解决的办法吗?

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        4 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        1.你取了中肠以后,先用pbs洗一下,然后直接放入lysis(+cocktail)中,研磨,研磨过程中全程冰上放置。研磨完以后,冰上放置5-10min,然后再离心,然后再加上样buffer煮。

        2,如果还是做不出来,可以考虑用液氮快速快速冰冻,然后用研钵研磨,然后加入lysis,冰上放置5-10min,然后再离心,然后再加上样buffer煮。

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        1、处死虫子,剪开腹腔,取出中肠组织。

        2、平皿中放入6ml预冷0.9%NaCL。

        3、在平皿中剪碎组织,并转移到匀浆器。

        4、预冷裂解液中添加PMSF(20ug/2ml)。

        5、取2ml预冷裂解缓冲液,迅速加入匀浆器,冰浴条件下充分研磨。

        6、组织研磨液转移至1.5ml离心管。

        7、4℃,15000rpm,离心10min。

        8、取上清组织蛋白粗提取液至新的1.5ml离心管。

        9、进行蛋白定量,-80℃保存。

        user-title

        灵枢天问

        有帮助

        要不然试试液氮快速冷冻然后研磨

        user-title

        whilt-shirt

        有帮助

        我们一般是用RIPA(强)裂解液,你可以试试这个

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