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        原核蛋白诱导表达

        相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

        user-title

        VPN会哦路

        我用pET32a载体,酶切位点EcoRI和XhoI,目的片段长度1326bp(没有终止子),诱导之后跑了胶,如下图:

        1:Marker,

        2:32a空载诱前;

        3:32a空载30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;

        4:重组载体诱前;

        5:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;

        6:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声上清;

        7:重组载体30℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声沉淀;

        8:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后;

        9:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声上清;

        10:重组载体20℃,0.5mMIPTG,220rpm,诱后超声沉淀;

        图片中显示,诱导后,出现了两个条带,我判断的是位于上面的那一条是我做的目的蛋白,下面一条是什么?我判断的对吗?大家可以看下吗,

        图片描述

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        3 个回答

        user-title

        冷泉港蛋白

        有帮助

        你的蛋白理论计算应该是20+46=66kd,

        1.上面的条带略高吧,也可以解释通。

        2.下面的条带应该是目的蛋白降解了,没有其他解释了,这个蛋白应该是超级不稳定。

        3.下面的条带如何证明是目的条带,抠胶打个质谱,花钱,也没有必要;纯化出来,37℃放置,第二天跑胶,估计就降解很多了

        4.如何解决这个降解问题,更换缓冲估计不行了,换载体吧

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        我感觉我好像昨天回答过这个问题,你的蛋白,按照1326bp计算,大概是50kd,再家上his-tag大概0.8 kd也到不了70多kd啊,所以你上面的那个条带可能是有别的修饰?要不你你找个抗体,用wb杂一下试试。

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        是不是你的蛋白有降解或者是它有非特异性条带呢?

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