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加入loading buffer煮沸后整个变红？

相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)

丁香实验

2022-01-12

之前提出的蛋白加入loading buffer煮沸后变红，更换了其他的loading buffer还是一样的结果。后来试着拿这个上样，结果样本上飘的很厉害，沉不下来。这应该是提的蛋白质有问题，但是为什么会这样呢？怎么处理

31 个回答

小布丁瑶瑶

2022-01-20

有帮助

可能是蛋白质酸性太强了，可以检测一下样品或ph值

dxyhsx123

2022-01-20

有帮助

这个问题没遇到过，一直都是蓝色。如果出现变色，应该是缓冲液的PH或者一些离子引起的，建议更换缓冲液浓度或者种类。

内科小护士

2022-01-18

有帮助

转膜，转膜时的温度，样品的浓度这些都是需要考虑的，严格控制转膜时的温度再加入loading buffer煮沸。

dxy_rlratyf3

2022-01-18

有帮助

煮沸后变红应该是酸性让loading buffer中的溴酚蓝显色了，样本上飘可能是溶剂的问题，因为有人用无水乙醇溶解样品就出现过类似的问题，可以换成1x PBS再试试。

lzy必有我师

2022-01-18

有帮助

步骤有不对吧！蛋白本身不会沉下去的，让它沉下去的是loading dye里的sucrose。重新配loading dye，按冷泉港protocol配，另外不要煮沸，95度煮5-10分钟即可

是小杨同学

2022-01-18

有帮助

可能是蛋白质酸性太强了，可以检测一下样品或ph值

隔壁家的小夜猫子

2022-01-18

有帮助

酸碱度的问题，太酸了怕沉淀，观察一下没沉淀就跑电泳就行，变性电泳不影响。有沉淀就溶不回来了啊，重新做样品之前调下PH值。

医往情深丁香园

2022-01-18

有帮助

估计应该是转膜的步骤有问题，或者是转膜的时候温度没有控制好造成的。

JCorona

2022-01-18

有帮助

确定是变红而不是变黄了吗？也可能是混色造成看似红色的原因哦。溴酚蓝在酸性条件下呈黄色，样本飘也可能是因为酸性对蛋白质的结构造成了损伤，甚至是使得蛋白质水解了。可以查一查是哪个环节引入了酸性条件，针对性地调整试验方案。

ZZDX-YILILI

2022-01-18

有帮助

应该是你提取的蛋白质太酸了，导致loading buffer中含有溴酚蓝加进去相当于在酸性环境中所以显示红色。溴酚蓝在4.6的情况下就显示蓝色了。

水深先试浅

2022-01-17

有帮助

我们是在提的时候就加了loading buffer，然后保存在-20，等上样的时候，再拿出来煮几分钟

verbalkint

2022-01-17

有帮助

蛋白本身不会沉下去的，让它沉下去的是loading dye里的sucrose。重新配loading dye，按冷泉港protocol配，另外不要煮沸，95度煮5-10分钟即可

一支肾上腺素

2022-01-17

有帮助

估计是上样步骤有错误，建议将各个样品稀释到某一固定浓度，加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分钟，使蛋白充分变性，也可使用PCR仪95度加热5分钟。

dxy_qkedgrg7

2022-01-17

有帮助

可能是蛋白提取有问题，看看提蛋白的试剂是否有问题，如果没有的话就是ph不对，ph过低会变成红的，可以用tris-hcl调一下ph

dxy_h7vcp8v3

2022-01-17

有帮助

蛋白质煮沸，不是上样必须的步骤。如果蛋白没有问题的话，可以采用不煮沸直接跑胶。如果，怀疑不是loading的原因而是蛋白的原因，就重新纯化蛋白质。如果，样品沉不到胶孔，可能是loading里甘油浓度不够，还有可能是纯化的并非蛋白质样品，而且别的杂质。建议，先确实蛋白质是否纯化正确。

jey1235

2022-01-17

有帮助

样品的pH有问题，建议查看样品的buffer或者是否有特殊试剂。可以直接加入SDS+DTT+glycerol 制备简单loading buffer。通过增加glycerol的比重可缓解上样飘的问题。另外样品根据是否需要native状态是否添加SDS和煮沸步骤。DTT是考虑是否打开二硫键。

zxb597

2022-01-17

有帮助

可能loading buffer pH值偏离，可能转膜有问题，样品浓度。

dxy_pni5ki46

2022-01-17

有帮助

不知道蛋白制备完是什么样子，我遇到过一次样品煮完变红是样品本身裂解完就有一点点红，加了loading buffer后蓝了一些，但是煮后变红，我推测是煮完ph偏酸性了溴酚蓝变黄色盖不住样品的红色了。我当时重新制备时用超滤管超滤了一下，洗了两遍，之后再制备的就正常了。我推测是样品中含有一些代谢产物的影响，我做的是肾脏。至于上不了样不知道样品煮完是否是粘稠有凝胶感，还是正常的样子，按正常有甘油就能沉下去，除非是样品中的什么物质和甘油反应？突然脑洞开了一下煮熟变红的不会是虾青素吧