虽然阳性样品能染出条带，但以前阳性质粒也没做出来，可能不会是转膜时间问题？

目的蛋白是10K，没有目的蛋白的抗体。1 我同时转了GFP，确实有绿色荧光2 western时带了一个以前有阳性的样品，此样品55KD，能染出来3 转染细胞时转染了以前有阳性的质粒，但western这两个质粒均没有条带，这两个样品45k4 western还做了Aactin, 都有条带转膜我用300mA,45min，15min还没有试。虽然阳性样品能染出条带，但以前阳性质粒也没做出来，可能不会是转膜时间问题。老师，现在我不知道问题出在哪一步，希望老师予以指导