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基因敲除到总结和展望 经典的基因敲除将靶基因在所有的组织器官中终生灭活，这就导致许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brcal、Brca2、Dpc4/Smad4等，在敲除后引起小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatio tempora ...

肽库的概念和分类 肽库(peptidelibraries)是大量特定长度且序列不同的小肽的集合，它包括了该长度短肽中各种(或绝大部分)氨基酸序列的排列组合。 肽库最早是Geyson及其同事在1986年提出的，他们认为：①蛋白质分子之间的结合或识别主要是由局部肽段上数个氨基酸残基间的相互作用来完成的，这些氨基酸之间形成非共价键联系；②有些多肽虽然其序列与抗原的天然表位不同，但在结合抗体 ...

噬菌怖肽库技术的发展历史 1982年，Dulbecco首先提出一种创造性的设想，他认为可以将病原体的抗原与入噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合并表达在其表面，这种表面表达有病原体抗原的病毒颗粒可以作为疫苗，由此第一个提出了表面展示(display)的概念并申请了美国专利。1985年，Smith首次证实了丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程技术进行这种改造，他将EcoRI核酸内切酶的部分基因片段 ...

噬菌怖肽库技术用于分析蛋白质的抗原表位 蛋白质的抗原表位即该蛋白质在参与抗原-抗体反应中直接与特异性抗体结合的氨基酸序列和构象。研究蛋白质的抗原表位对于了解蛋白质的结构与功能、分子识别的基础是十分重要的，也为多肽药物的筛选、疾病新型诊断抗原以及多肽疫苗的研制提供重要的依据和线索。 目前广泛用于蛋白质抗原表位的分析方法主要是肽扫描，即按照蛋白质氨基酸的序列，合成多个线形的重叠肽，再利 ...

噬菌怖肽库技术用于发展新型诊断抗原和疫苗 噬菌体肽库技术可以用于筛选疾病特异性抗原表位，在疾病的诊断、治疗以及新型疫苗的研制方面具有广泛的应用前景。感染或曾经感染过某种病原体的患者，其血清中往往存在有相应的病原体特异性抗体，临床上可以通过检测这些抗体来知道患者感染的状况。常规检测这些抗体的方法需要有诊断抗原，而这些抗原通常是纯化的病原体天然抗原或者是通过基因工程技术表达和纯化的重组抗原。但 ...

噬菌怖肽库技术在新型药物设计中的应用 传统药物的开发一般是从自然界的动物、植物和微生物中分离出具有特定药理作用的化学物质或蛋白质(多肽)，然后对于化学物质(一般是作为药物研究的先导化合物)再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。目前大部分药物是通过这些方法获得的，但此方法往往周期长、风险高、耗资巨大，并带有很大的 ...

丝状噬菌体的生活史 野生型Pf类丝状噬菌体只能感染带有F性菌毛的雄性大肠杆菌。当噬菌体感染大肠杆菌时，先通过其头部的pⅢ蛋白N端吸附于大肠杆菌F性菌毛的末端，脱去主要衣壳蛋白pⅧ，其感染性单链DNA则进入宿主细胞细菌，并在10～15min内，首先在宿主胞内酶的作用下，以此环状单链的DNA为正链，通过滚环复制拷贝出互补的负链DNA，形成环状双链DiNA分子即复制型DNA(RFDNA)。这种双 ...

丝状噬菌体的基因与蛋白质 丝状噬菌体(filamentousphage)是一类大肠杆菌的噬菌体，细丝状，直径约6nm，长度约1um。用于噬菌体肽库展示的主要是Ff组的M13、f1、fd等噬菌体，这3类噬菌体的亲缘关系十分密切，核酸序列有98％以上的同源性，病毒粒子的大小和结构非常相似，生活周期也相同。这些噬菌体为雄性特异性噬菌体，只能感染有F性因子或F，因子的雄性大肠杆菌菌株，但噬菌体的基 ...

噬菌体肽库技术的原理 噬菌体肽库技术实际上是通过噬菌体展示技术将一定长度的所有外源多肽展示于噬菌体载体表面，实现基因表达产物与亲和筛选相结合的一种技术。以噬菌体为载体，把一段特定长度、随机合成的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质(如pⅢ和pⅧ)N端的编码基因中，使这段基因编码的相应外源多肽在噬菌体外壳蛋白的N端以融合蛋白的方式表达并展示于噬菌体颗粒的表面，而且这种插入的外源多肽不影响和于扰噬 ...

噬菌体表面展示方式 目前在噬菌体肽库技术中，主要用于表面展示肽库的方式有两种：pⅢ蛋白展示方式和pⅧ蛋白展示方式。展示系统又可分为噬菌体表面展示系统和噬菌粒(phagmid)表面展示系统。 噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽或蛋白质，在基因工程操作上基本相同：在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有一个可以插入外源基因片段的克隆位点，插入的外源基因编码的蛋白与pⅢ和pⅧ以融合蛋白的形式 ...

噬菌体表面展示系统 1．噬茵体展示系统 噬菌体展示系统是在野生性丝状噬菌体的基因组基础上改造而成，保留了噬菌体完成整个生活史所必需的基因，包括感染宿主、DNA复制、包装蛋白质合成以及病毒组装的基因，还包含一个抗生素的遗传标记和一个多克隆限制性酶切位点。 噬菌体载体不需要辅助噬菌体，比较稳定。但由于DNA基因组大(相对分子质量为9 000～10 000)，回收DNA的产量低， ...

噬菌体肽库技术的特点 (1)在噬菌体表面展示的融合蛋白或肽直接有效地与其编码基因密切偶联在一起，因而在获得多肽的同时通过对噬菌体单链DNA插入DNA进行测序，从而得到了多肽的编码基因。 (2)库容量大(目前可达到1010)，选择范围广泛，可能筛选到针对某个生物大分子的新型特异性结合肽，甚至是自然界中不能天然产生的但具有高亲和力的配体分子。而且筛选到的多肽结构多样，为进一步分析研究蛋 ...

噬菌体肽库到构建方法 利用噬菌体展示技术建立随机肽库的方法是：通过化学合成的方法，随机合成特定长度肽的寡核苷酸片段，然后通过基因工程重组技术插入至噬菌体载体的外壳蛋白编码基因中并转化大肠杆菌，增殖和产生的噬菌体其表面携带有外源多肽，每个噬菌体表面表达一种外源肽，所有这些噬菌体构成随机肽库。利用目标分子从整个噬菌体随机肽库中经筛选一扩增一筛选等步骤，最后获得能与靶分子高亲和力结合的噬菌体克隆 ...

构建噬菌体肽库的密码子选择 要建立一定长度的肽库，首先就是要人工合成相应长度的核苷酸随机序列，理论上核苷酸序列随机性越大，则肽库的多样性就越丰富。如密码子采用NNN合成方式，理论上可以得到所有可能且完全随机的氨基酸序列。但实际上其中有很多序列因存在着终止子而得不到表达，因此要尽量减少终止子在核苷酸序列中出现的频率。终止子有3个：TAA、TGA和TAG，因此密码子的合成方式一般选择(NNK) ...

随机肽的长度以及肽库的多样性 随机肽库的多样性标准和质量是以库容量来评价的。理论上，噬菌体展示的肽段越长，其肽库多样性即库容量就越高，筛选的成功率就越大。但实际上肽库的多样性或库容量是受到多种因素限制的，除了上面所讨论的受到合成时密码子的限制外，还受到DNA转化效率和宿主大肠杆菌体内生物性“选择”等因素的限制，如有些对宿主细胞不利的多肽一般是很难存在的。目前库容量一般只能达到109-101 ...

编码15肽随机DNA片段的克隆 (1)M13KE载体的大量酶切 双酶切反应体系： M13KE载体(1ug) 2 ul H2O 32 ul 10XNE Buffer 3 4 ul EagI(10 U／ul) 1 ul Acc65 1(

肽库的筛选方法 噬菌体肽库筛选总的指导思想是利用有些生物大分子之间存在着不同大小的亲和力，以生物大分子为靶目标，通过直接或多轮筛选可以从肽库中筛选得到相应的且具有特定亲和力的结合肽。噬菌体肽库筛选方法一般采用生物学筛选技术，又称为生物淘洗(biopanning)，即利用生物操作方法从噬菌体随机肽库中筛选出所需的噬菌体肽。筛选方法可以因筛选靶目标的性质、筛选的规模而不同，并且与操作人员的习惯 ...

以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法 (1)大肠杆菌KglKan的活化：用无菌接种针从菌种甘油保存液中蘸取少量菌液，划线接种于LB-Kan平板上，翻转平板，于37℃培养过夜；次日培养平板用石蜡膜封口后，在4℃中保存不超过1个月。 (2)大肠杆菌K91Kan感受态细胞的制备：取lmlLB液体培养基于15m1指管中，加入1ulKan(100ug/m1)，从培养平板中挑选大肠 ...

以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库模拟抗原的筛选 (1)将单克隆抗体用包被液CBS稀释，加入酶标板，一般抗体包被浓度为10ug/孔，包被体积为100ul/孔，稍加晃动使孔表面变湿，置于4℃下包被过夜(或37℃慢摇孵育2h)。第二天倾去板中包被液，每孔加入200ul/孔洗板液(PBST05)，静置5rain，甩去洗板液，于无菌干净的滤纸上拍打，以尽量除去剩余的液体，重复洗5次，以下的洗板操作都与 ...

以蛋白分子为靶目标噬菌体肽的鉴定 (1)ELISA鉴定：用牙签轻触筛选到的并单克隆化的含噬菌体单菌落，将其投入已放有1m1 B-Kanl00-Tet40液体培养基的15ml试管中，37℃震荡(270r/rain)培养24h。离心除去菌体，得到上清液，即单克隆的噬菌体，可直接用于鉴定。将单克隆抗体用CBS稀释成一定浓度，以100ul/孔包被96孔酶标板，于4℃下包被过夜(或37℃孵育2 h) ...