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酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于细胞ELISA 应用酶标抗体进行免疫测定的方法较多，非均相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类酶免疫检测技术，其中以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最常用，它可用于测定抗体，也可测定可溶性抗原及细胞抗原。而酶-抗酶复合物多用于免疫组织化学。以下着重介绍ELISA（包括双抗体夹心法、细胞ELISA和 ...

核苷和核苷酸的标记〔γ-32P〕-ATP标记 基因工程已广泛应用于医学诊断、重组新的分子、物种和品系。32P-核苷酸类在基因工程研究中不可缺少的核素标记的化合物。制备这类标记化合物的方法有化学合成法、化学酶促合成法和酶促合成法等。其中常用酶促合成法最常用，其优点是需要设备少，操作简便，时间短，易防护，标记物的放射性比活度高，能够满足基因工程中进行DNA标记及分子杂交等工作要求。【基本原 ...

酶标抗体和酶-抗酶复合物的应用于免疫酶组化技术（APAAP法）【基本原理】 碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色法(APAAP法)，是一种免疫组化技术。用兔抗鼠IgG起搭桥作用，其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的存在。该方法由于使用免疫桥联技术，故其敏感性高，结果易于判断，同时又减少了内源性酶的影 ...

蛋白质、多肽的放射性核素（125I）的标记氯胺T法（ch-T法）【基本原理】反应原理不清楚，仅仅是建立在实验基础上，有的学者认为当氯胺T溶于水后释放出次氯酸，将I~F离子氧化成I2、I~D，在pH为7.0-8.0条件下与蛋白质酪氨酸残基上邻位氢原子发生置换反应，形成放射性碘标记化合物，用偏重亚硫酸钠终止氧化反应，经过分离纯化，获得纯的标记化合物。【试剂及材料】（1）0.05mol/L和0.1m ...

放射免疫分析技术(用核素标记的抗原检测抗原)【基本原理】 放射免疫分析技术（radioimmunoassay，RIA）一般采用竞争结合分析技术。其基本原理为放射性标记抗原和被测抗原（或标准品）对有限的特异性抗体发生可逆性的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物量与被测物的含量呈负相关。当抗体的量固定不变时，免疫复合物的形成就受到待测抗原含量的制约。如反应系统中待测Ag含量高时，对A ...

免疫放射分析技术（用核素标记的抗体检测抗原） 1968年Miles和Hales建立了利用核素标记的抗体检测抗原的放射分析法，为了与放射免疫分析区别，故称免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）。由于它应用核素标记抗体作为示踪剂，在反应体系中加入过量的抗体，待测抗原（或标准品）与和核素标记抗体进行全量反应，故亦称非竞争性免疫分析法。IRMA与RIA相比较有 ...

受体的放射配体结合分析技术 受体是存在于细胞表面、胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子（配体）特异性结合，将信息转变为生物效应。受体现已可从细胞或组织中分离、提取，进行定量和定位分析。放射受体分析（radioreceptor assay，RRA）或受体的放射配体结合分析（radioligand binding assay，RBA）是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反 ...

免疫金标记技术 胶体金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶液，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。1971年，Faulk和taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究，随着技术的不断改进和完善，免疫金标记术已建立了免疫转印、流式细胞 ...

彩色免疫金银染色法【基本原理】 彩色免疫金银染色法是抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂反应被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变为有色的染料并沉积在银颗粒部位，金属银变成银离子。【试剂及材料】（1）Lugol’s碘液（2）含5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠溶液（3）2%铁氰化钾和1%溴化钾溶液（4）其余试剂同上【 ...

胶体金的制备 胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。根据实验需要，可以利用不同的还原剂制备成直径大小不同的胶体金颗粒。（一）白磷还原法【试剂及材料】（1）HAuCl4水溶液（2）0.2mol/L K2CO3（3）白磷乙醚饱和液：在水中将白磷切成小片，用镊子快速取出，在滤纸上吸干后，放入小瓶，迅速加入10ml纯乙醚，塞紧瓶口，轻轻摇动至少2h，使乙醚充 ...

免疫金银染色法是利用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中的银离子在还原剂（对苯二酚）存在情况下被还原成银原子，在金颗粒周围形成一个“银壳”，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。【试剂及材料】（1）0．5%胰蛋白酶或胃蛋白酶：用0.05mol/L ...

胶体金标记蛋白的制备【基本原理】 胶体金标记实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附的机理可能是胶体金表面所带的负电荷与蛋白质分子所带的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力内即形成牢固的结合。另外，胶体金颗粒的粗糙也是有利于形成吸附的重要条件。由于这种标记过程主要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子的生物学活性没有明显影响。【试剂及材料】（1）胶体金溶液（2） ...

斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS） 1984年，Moeremans等将斑点酶联免疫吸附法（dot-ELISA）与免疫金银染色法相结合，建立了固相载体上的斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与特异性抗体反应后，在滴加（或浸入）胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的 ...

斑点金免疫渗滤测定法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）【基本原理】斑点金免疫渗滤测定法是在斑点免疫渗滤测定法基础上，改用胶体金标记物代替酶，省去底物显色的步骤。试验方法是以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将试剂及标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应。全过程可于数分钟内完成，阳性结果在膜上呈红色斑点。【试剂及材料】（1）渗滤装置：为一塑料小盒（4x3x0. ...

PCR反应体系的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)&nbs

标准PCR方法典型的PCR扩增必须具备下述基本条件以构成PCR反应体系：10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液： 10～50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5～9.0) 6～50 mmol/L KCl或 (NH4)2SO4 1.5～5 mmol/L MgCl2或 MgSO40.2 mmol/L dATP dCTP dGTPdTTP0.1～1μmol/L ...

PCR反应体系的模板 几乎所有形式的DNA和RNA都是PCR反应的合适底物，包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA。大多数PCR操作中对DNA模板的要求都不高纯度要求亦不严用量很低。理论上单拷贝基因都可以扩增但从高度复杂的DNA样品中进行扩增可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些，如在PCR反应前用机械剪切或稀有限制酶消化基因组DNA可提高产量。 ...

PCR 基本原理 PCR实际上是通过引物延伸核酸的某个区域而进行重复双向DNA合成，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法其特异性由引物序列决定。 PCR扩增一个模板需要一对寡核苷酸引物、4种脱氧核糖核苷酸（4dNTP）、摩尔数超过dNTP的镁离子和进行DNA合成的耐热的DNA聚合酶。一般情况下这两段寡核苷酸引物分别与模板DNA上待扩增DNA区段两侧的一段序列互补，并能进行特 ...

PCR反应体系的寡聚核苷酸引物 PCR扩增要选择和设计适当的特异性引物。　　(一)引物设计的原则 　1.一般原则　　(1)引物长度应在15～30bp。其Tm=（G+C）×4+（A+T）×2，引物的有效长度Ln=2(G+C)+(A+T)； Ln38时最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃不能保证引物的特异性。　　(2)引物中碱基的分布应当是随机的避免一连串相同的碱基。3， ...

PCR反应体系的Mg2+的浓度 Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外也影响引物的退火 模板与PCR产物的解链温度产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时酶活力明显降低;过高时酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5～2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板会干扰Mg2+的浓度。因此 ...