原位杂交操作规程
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一、仪器设备
医用微波炉； 水浴锅。
二、试剂
0.2 mol/L HCl：HCl 8.2 ml，H2O 定容0.5 L。
0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)：三乙醇胺 5.33 ml，H2O 定容0.4 L。
0.5 ml/L 醋酸-2.5 ml/L 醋酸酐：三乙醇胺 13.2 ml，NaCl 5 g，浓HCl 4 ml，H2O 定容0.98 L，醋酸酐 （用前加）2.5 ml。
20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3 g，枸橼酸钠 88.2 g，H2O定容1 L。
100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1 g，BSA 1 g，H2O 定容50 ml。
杂交液：Formamide 5 ml，20×SSC 2.5 ml，Dextran sulfate 1 g，100×Denhardt's 0.5 ml，10%SDS 0.5 ml，10 g/L sperm DNA 0.1 ml，H2O 1.4 L。
BufferⅠ（pH7.5）：0.1 mol/L ris·Cl，0.15 mol/L NaCl。
BufferⅢ（pH9.5）：0.1 mol/L Tris·Cl，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl2。
BufferⅣ（pH8.0）：10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA。
三、操作流程
1. 使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天。
（1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
（2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；
（3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；
（4） PBS清洗3分钟；
（5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
（6） PBS清洗10分钟；
（7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；
（8） PBS清洗2次，每次3分钟；
（9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
（10）PBS清洗2次，每次3分钟；
（11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
（12）PBS清洗2次，每次5分钟；
（13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
（14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；
（15）杂交；第二天
（16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；
（17）PBS清洗3分钟；
（18）RNA酶A溶液中（或0.1-1 ng/ml PBS中），37℃孵育30分钟；
（19）PBS清洗5分钟；
（20）室温，2×SSC清洗10分钟；
（21）37℃，1×SSC清洗10分钟；
（22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
（23）缓冲液A孵育10分钟；
（24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；
（25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；
（26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；
（27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
（28）制成NBT/BCIP暗处保存30~60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；
（29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
（30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2. 使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天。
（1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
（2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
（3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
（4） PBS清洗5分钟；
（5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
（6） PBS清洗5分钟；
（7） 加入胃蛋白酶25 μl/ml，37℃孵育10分钟；
（8） PBS清洗2次，每次5分钟；
（9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
（10）PBS清洗2次，每次5分钟；
（11）0.25%无水乙酸和0.1 M 三乙醇胺孵育10分钟；
（12）PBS清洗5分钟；
（13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
（14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
（15）杂交；第二天
（16）将玻片置于SSC中以去除封片；
（17）室温，2×SSC清洗10分钟；
（18）37℃，1×SSC清洗10分钟；
（19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
（20）缓冲液A孵育10分钟；
（21）缓冲液A孵育30分钟；
（22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
（23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
（24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
（25）制成NBT/BCIP暗处保存30~60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
（26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
（27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
