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        放射性碘标记:乳过氧化物酶法(LPO)

        互联网

        2052
         本法反应温和,对抗原、抗体免疫活性影响小,已被广泛应用。缺点是标记率较低,一般为20~40%。
          1.原理此法是利用乳过氧化物酶(Lactoperoxidase)有促进微量过氧化氢对 125 I - 的氧化作用,生成 125 I + ,并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。
          2.方法以标记蛋白质抗原为例。
          (1)反应液组成:蛋白质2~5μg溶于磷酸缓冲液10~25μl中,加入Na 125 i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H 2 O 2 200ng(10μl);
          (2)在室温保温7min;
          (3)加入H 2 O 2 200ng(10μl);
          (4)过7min再加入H 2 O 2 (3μl);
          (5)保温7min后,加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应;
          (6)10min后加入NaI载体溶液1ml ;
          (7)按常规方法分离纯化。
          3.注意事项
          (1)LPO质量好坏,可直接影响标记率,LPO应在使用前新鲜配制,以防酶活性降低。
          (2)LPO用量应小于 总蛋白 质用量的1%,以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。
          (3)碘化反应速率分析表明,酶的催化速度很快。
          (4)碘化反应在pH4.0~8.5较宽范围内均可进行,最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。
          (5)H 2 O 2 应保持低浓度,如高于0.1mmol/L,对酶的活性将有抑制作用。
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