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        DD-PCR

        互联网

        6850

        实验试剂

         

        T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统

        实验设备

         

        PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

        实验步骤

         

        1. 总RNA提取(略)

        2. 残留DNA的去除

        反应体系

                  1－5ugRNA

                  10×DNA酶缓冲液   2ul

                  RNA酶抑制剂       1ul

                  无RNA酶的DNase   1u

                  加DEPC水   至    20ul

        混匀，37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥

        3. RT    5×RT缓冲液     4ul

                 0.2ug总RNA

                 10umT12N        1ul

                 加DEPC水 至   10ul

             80℃ 1min  42℃ 5min  再加入

                 10mMdNTP                2ul

                100mMDTT                 1ul

                 50nMMgCl2               1.3ul

                 RNA酶抑制剂(40u/ul)     1ul   

                 MMLV(200u/ul)           1ul

                 加DEPC水至            20ul

                37℃  1小时， 90℃ 1min

        4. PCR  上述RT液               4ul

                10×PCR缓冲液          1ul

                25mM MgCl2               1ul           94℃    1min

                10mMdNTP              0.4ul           94℃   30’

                dT12M                 0.2ul           40℃   30’     40循环

                10mer随机引物         0.2ul           72℃   45’

                水                    3.9ul           72℃    6min

                Taq酶（5u/ul）       0.1ul

             混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。

        5. 检测 龈染检测(略)

        6. 差异带切割、回收操作(略)

        7.  回收差异带二次扩增

               回收的差异带稀释    50－100倍

                10×PCR缓冲液          1ul

                25mM MgCl2               1ul       94℃    1min    94℃   45’

                10mMdNTP              0.4ul       94℃   45’      42℃   45’

                dT12M                 0.2ul       40℃   45’      72℃   60’

                10mer随机引物         0.2ul      72℃   60’        20循环

                加水至                10ul        20循环        72℃   6min

                Taq酶（5u/ul）       0.1ul

        8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)

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