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    DD-PCR

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    实验试剂

     

    T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统

    实验设备

     

    PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

    实验步骤

     

    1. 总RNA提取(略)

    2. 残留DNA的去除

    反应体系

              1－5ugRNA

              10×DNA酶缓冲液   2ul

              RNA酶抑制剂       1ul

              无RNA酶的DNase   1u

              加DEPC水   至    20ul

    混匀，37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥

    3. RT    5×RT缓冲液     4ul

             0.2ug总RNA

             10umT12N        1ul

             加DEPC水 至   10ul

         80℃ 1min  42℃ 5min  再加入

             10mMdNTP                2ul

            100mMDTT                 1ul

             50nMMgCl2               1.3ul

             RNA酶抑制剂(40u/ul)     1ul   

             MMLV(200u/ul)           1ul

             加DEPC水至            20ul

            37℃  1小时， 90℃ 1min

    4. PCR  上述RT液               4ul

            10×PCR缓冲液          1ul

            25mM MgCl2               1ul           94℃    1min

            10mMdNTP              0.4ul           94℃   30’

            dT12M                 0.2ul           40℃   30’     40循环

            10mer随机引物         0.2ul           72℃   45’

            水                    3.9ul           72℃    6min

            Taq酶（5u/ul）       0.1ul

         混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。

    5. 检测 龈染检测(略)

    6. 差异带切割、回收操作(略)

    7.  回收差异带二次扩增

           回收的差异带稀释    50－100倍

            10×PCR缓冲液          1ul

            25mM MgCl2               1ul       94℃    1min    94℃   45’

            10mMdNTP              0.4ul       94℃   45’      42℃   45’

            dT12M                 0.2ul       40℃   45’      72℃   60’

            10mer随机引物         0.2ul      72℃   60’        20循环

            加水至                10ul        20循环        72℃   6min

            Taq酶（5u/ul）       0.1ul

    8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)

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