互联网2013-11-13
T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统
PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备
1. 总RNA提取(略)
2. 残留DNA的去除
反应体系
1－5ugRNA
10×DNA酶缓冲液 2ul
RNA酶抑制剂 1ul
无RNA酶的DNase 1u
加DEPC水 至 20ul
混匀，37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥
3. RT 5×RT缓冲液 4ul
0.2ug总RNA
10umT12N 1ul
加DEPC水 至 10ul
80℃ 1min 42℃ 5min 再加入
10mMdNTP 2ul
100mMDTT 1ul
50nMMgCl2 1.3ul
RNA酶抑制剂(40u/ul) 1ul
MMLV(200u/ul) 1ul
加DEPC水至 20ul
37℃ 1小时， 90℃ 1min
4. PCR 上述RT液 4ul
10×PCR缓冲液 1ul
25mM MgCl2 1ul 94℃ 1min
10mMdNTP 0.4ul 94℃ 30’
dT12M 0.2ul 40℃ 30’ 40循环
10mer随机引物 0.2ul 72℃ 45’
水 3.9ul 72℃ 6min
Taq酶（5u/ul） 0.1ul
混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。
5. 检测 龈染检测(略)
6. 差异带切割、回收操作(略)
7. 回收差异带二次扩增
回收的差异带稀释 50－100倍
25mM MgCl2 1ul 94℃ 1min 94℃ 45’
10mMdNTP 0.4ul 94℃ 45’ 42℃ 45’
dT12M 0.2ul 40℃ 45’ 72℃ 60’
10mer随机引物 0.2ul 72℃ 60’ 20循环
加水至 10ul 20循环 72℃ 6min
8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)
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