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        DNA沉淀法提取C1q

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        1454

        实验试剂

         

        1. pH值8.6、0.025mol/L巴比妥EDTA缓冲液(含0.01mol/L EDTA)；

        2. 小牛胸腺DNA；

        3. pH值6.9、0.05mol/L PB；

        4. DNA酶溶液，每毫升pH值6.9、0.05mol/L PB中含MgCl2 0.003mol/L、1mg DNase；

        5. pH值5.3、0.3mol/L PB；

        6. pH值5.1、0.02mol/L PB(含0.01mol/L EDTA)；

        7. 1mol/L NaCl。

        实验设备

         

        1. 磁力搅拌器；

        2. 离心机(最好是恒温高速)；

        3. 25×100cm和25×50cm层析柱各一支；

        4. 电导仪；

        5. Sephadex G200。

        实验步骤

         

        1. 将血清装入透析袋中，用pH值8.6、0.05mol/L巴比妥DETA缓冲液在4℃透析过夜，测定袋内外导电率和pH值是否相等，如相等，则表示透析完成，1000r/min，离心30min，除去非特异性沉淀物；

        2. 按每毫升125μg加入DNA，室温搅拌1h，4℃放置24h；

        3. 1000r/min离心30min取沉淀物，用pH值6.9 PB洗4次；

        4. 每毫升沉淀物中加入DNA酶溶液0.1ml，混悬液用1mol/L HCl调整pH值为6.9；

        5. 37℃搅拌1h或室温3h，将DNA消化，搅拌后放于pH值6.9、0.05mol/L PB中透析，直到沉淀物大部分溶解(透析液最好含MgCl2 0.3mmol/L和NaCl 0.05mol/L)，10 000r/min离心30min，去除沉淀物；

        6. 上清液过Sephadex G200柱(柱长100cm)，用pH值5.3、0.3mol/L PB洗脱，以除去DNase和DNA消化产物，将C1q峰收集后，加2.8%硫酸铵使之沉淀(4℃)，5h后离心沉淀，沉淀物溶于pH值7.0、0.1mol/L PB中，并用此缓冲液透析过夜，再离心除去不溶物，上清液即为纯化90%以上的C1q，可用于双扩散试验，用于放射免疫试验则需进一步纯化；

        7. 过柱浓缩物用pH值5.1、0.02mol/L PB(内含0.01mol/L EDTA)平衡，过羧甲基(CM)纤维素柱(柱长50cm)，用平衡缓冲液加上限1mol/L NaCl作为梯度洗脱(电导率5～25mS之间)，C1q在8mS电导时洗脱下来；

        8. 洗脱物浓缩、分装、低温保存。

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