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        细胞膜蛋白的分离

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        3325

        实验试剂

         

        1. 方法一

        缓冲液A:1mM KCl,5mM NaCl,3mM MgCl2 ,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM PMSF(PH=7.4)
        缓冲液B:1mM KCl,5mM NaCl,3mM MgCl2 ,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM PMSF(PH=7.4),1mM EGTA
        缓冲液C:0.5ug/ml Leupeptin,20uM PMSF,50mMTris-Cl (PH=7.0)

        2. 方法二
        2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl(pH7.5)、蛋白酶抑制剂缓冲液A(含0.5mol/LNaCl的RIPA 缓冲液)
        缓冲液C
        10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
        150mmol/L NaCl
        5mmol/L EDTA(PH7.5)

        实验步骤

         

        1. 方法一
           1) 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中,于室温与液氮罐中反复冻融2次。
           2) 5000转4度离心,驱除核及未裂解的细胞。
           3) 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
           4) 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,分装后-20度保存备用。

        2. 方法二
           1) 细胞放在冰上,去除上清,用pH7.4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次。
           2) 加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min。
           3) 刮下单层细胞,4度下10 000g 5min离心。
           4) 溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相,然后37度下2 000g离心5min。
           5) 收集水相留作分析。
           6) 用500ul冰冷的缓冲液C溶解去污剂相沉淀,冰浴2min后加温,在按步骤6再次离心。
           7) 按步骤8再次抽提去污剂相,用缓冲液 C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积。
           8) 用等量的缓冲液A分别稀释水相与去污相,并进行免疫沉淀实验。

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