制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧
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1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理, 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等,确切的结合原理并不明确,主要靠假说来支撑. 主要有两种假说:
1) 首先两者靠静电作用力结合, 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合.
2) 首先两者靠疏水作用结合, 然后靠静电作用来维持长时间结合.
两条假说, 都表明其结合过程分为两步, 首先结合和后面长时间结合. 由于结合原理的不明确性, 导致在这方面的工作非常依赖实践经验.
2. 膜对结合的影响
1)膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜,但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品,如果是不同厂家的产品,这种比较是无意义的. 膜孔径与层析速度的关系,已在上文描述.
随着膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率).
另外, 膜孔径越小,层析速度也越小,那么金标复合物通过T线的时间也就越长,反应也就越充分.
综合以上两点,结论为膜孔径越小灵敏度越高. 但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高. 所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜,找到合适的平衡点.
2)不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点:
1)生产膜时,使用的聚合物和表面活性剂的来源,类型,数量不同. 同理,在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响.
2)处理过程不同.
3. 生物原料,缓冲溶液的试剂和配方
1) 生物原料, 作为CT线的生物原料使用情况各异,所以这里只做略述.
首先,单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体, 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点, 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别, 毫无疑问就增加了优化难度.
其次,分子量越大,蛋白越难结合到固相材料上.
2)缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方,包括缓冲液,封闭液等等处理溶液配方.
其实我也无法提供给你一个万用配方清单. 因为不同的反应体系需要不同的配方来支持, 而不同机构的反应体系又有差异. 想获”鱼”先学”渔”. 为了不误导大家,我在下面涉及到配方的问题上,仅提供思路,具体配方请自己摸索.
缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后,个人意见为配方原则为宜简不宜繁,根据自己的需要添加作用物质,原来的很多需要添加的作用物质,由于膜制造技术的改进已经不再需要.
推荐的缓冲体系为0. 01M PBS PH7-7. 2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性.
作用物质的情况大致罗列如下:
少量NACL,减少信号强度,消假阳.
有机醇(甲醇,异丙醇等),润湿膜,减少膜带有的静电,利于结合包被. 个人不推荐,因制膜工艺改进.
表面活性剂(TW20,TX100),增加亲水力,可避免线条中空现象,也可增色.
糖,保护剂,减缓老化速度,也可以增加亲水力同上.
调PH到某个位置,可以消假阳.
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要. 最佳湿度一般在45-65%.
湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试会出现疏水斑.
湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起CT线变宽甚至扩散.
为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间.
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式,划膜式和非接触点膜式. 非接触点膜式优于划膜式,进口划膜式优于国产划膜式.
因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕. 进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好,所以留下的划痕较轻,而国产仪器较差,留下的划痕也就比较严重. 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性. 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线),而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象.
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18 mm(or 20 mm)和25 mm两种, 分别使用在做测试条和做测试板上.
然而,不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度. 点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高. 反之灵敏度降低. 这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性.
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1 ul/cm.
溶液在膜上的扩散是趋向两端的,喷点上去的是均匀的抗体溶液,但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间,中间的抗体会不断向两边扩散,所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的. 一般情况下不影响你的试验. 如果你发现线条出现两端红,中间淡的现象,就要考虑这个问题了. 可以加如上面说的作用物质来解决.
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用. 然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论.
其实封闭不象大家认为的那样,一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了,而且更麻烦,我要说的是慎用封闭.
我极其反对点膜前封闭的做法. 原因为厂家在生产膜时候,各种配方是混合加入原浆的. 而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内,必然扰乱了膜内正常的物质分布. 由此引发了许多问题,也降低了工作效率. 也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题,其实可以通过其他办法来解决,封闭必然是下测.
我经常使用的封闭手法有两种.
流动封闭,将作用物质处理在样品垫上.
膜上定点封闭,将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上. 该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头. 可以将不合格的半成品大板重新复活.
只要是将封闭做在了膜上,就必然会对产品的稳定性造成影响. 具体的影响程度要通过稳定性测试来评判.
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分. 关于膜的老化机理,有个理论支持,不过争议比较大. 理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发,使膜变得疏水,带电荷并变脆. 储存膜一般要求是避光,密封. 过干或过湿都不利. 在这种保存条件下,一般可以放置两年. 但是如果膜上做了封闭处理,就要根据具体试验情况来判断了.
有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定后方可进入调试生产.
后序
以上便是我在胶体金层析诊断试验中使用硝酸纤维素膜过程中的一些经验. 从起笔到结尾花了大约一个月时间,断断续续,终于完成. 也要感谢所有膜生产厂家技术专家在以前的工作接触中给我做过的大量技术培训,其中很多已经成为了经常联系的朋友. 由于膜工业是在不断发展的,可能出现新的问题或新的解决办法. 欢迎进行讨论。
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理, 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等,确切的结合原理并不明确,主要靠假说来支撑. 主要有两种假说:
1) 首先两者靠静电作用力结合, 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合.
2) 首先两者靠疏水作用结合, 然后靠静电作用来维持长时间结合.
两条假说, 都表明其结合过程分为两步, 首先结合和后面长时间结合. 由于结合原理的不明确性, 导致在这方面的工作非常依赖实践经验.
2. 膜对结合的影响
1)膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜,但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品,如果是不同厂家的产品,这种比较是无意义的. 膜孔径与层析速度的关系,已在上文描述.
随着膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率).
另外, 膜孔径越小,层析速度也越小,那么金标复合物通过T线的时间也就越长,反应也就越充分.
综合以上两点,结论为膜孔径越小灵敏度越高. 但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高. 所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜,找到合适的平衡点.
2)不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点:
1)生产膜时,使用的聚合物和表面活性剂的来源,类型,数量不同. 同理,在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响.
2)处理过程不同.
3. 生物原料,缓冲溶液的试剂和配方
1) 生物原料, 作为CT线的生物原料使用情况各异,所以这里只做略述.
首先,单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体, 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点, 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别, 毫无疑问就增加了优化难度.
其次,分子量越大,蛋白越难结合到固相材料上.
2)缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方,包括缓冲液,封闭液等等处理溶液配方.
其实我也无法提供给你一个万用配方清单. 因为不同的反应体系需要不同的配方来支持, 而不同机构的反应体系又有差异. 想获”鱼”先学”渔”. 为了不误导大家,我在下面涉及到配方的问题上,仅提供思路,具体配方请自己摸索.
缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后,个人意见为配方原则为宜简不宜繁,根据自己的需要添加作用物质,原来的很多需要添加的作用物质,由于膜制造技术的改进已经不再需要.
推荐的缓冲体系为0. 01M PBS PH7-7. 2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性.
作用物质的情况大致罗列如下:
少量NACL,减少信号强度,消假阳.
有机醇(甲醇,异丙醇等),润湿膜,减少膜带有的静电,利于结合包被. 个人不推荐,因制膜工艺改进.
表面活性剂(TW20,TX100),增加亲水力,可避免线条中空现象,也可增色.
糖,保护剂,减缓老化速度,也可以增加亲水力同上.
调PH到某个位置,可以消假阳.
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要. 最佳湿度一般在45-65%.
湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试会出现疏水斑.
湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起CT线变宽甚至扩散.
为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间.
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式,划膜式和非接触点膜式. 非接触点膜式优于划膜式,进口划膜式优于国产划膜式.
因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕. 进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好,所以留下的划痕较轻,而国产仪器较差,留下的划痕也就比较严重. 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性. 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线),而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象.
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18 mm(or 20 mm)和25 mm两种, 分别使用在做测试条和做测试板上.
然而,不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度. 点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高. 反之灵敏度降低. 这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性.
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1 ul/cm.
溶液在膜上的扩散是趋向两端的,喷点上去的是均匀的抗体溶液,但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间,中间的抗体会不断向两边扩散,所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的. 一般情况下不影响你的试验. 如果你发现线条出现两端红,中间淡的现象,就要考虑这个问题了. 可以加如上面说的作用物质来解决.
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用. 然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论.
其实封闭不象大家认为的那样,一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了,而且更麻烦,我要说的是慎用封闭.
我极其反对点膜前封闭的做法. 原因为厂家在生产膜时候,各种配方是混合加入原浆的. 而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内,必然扰乱了膜内正常的物质分布. 由此引发了许多问题,也降低了工作效率. 也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题,其实可以通过其他办法来解决,封闭必然是下测.
我经常使用的封闭手法有两种.
流动封闭,将作用物质处理在样品垫上.
膜上定点封闭,将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上. 该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头. 可以将不合格的半成品大板重新复活.
只要是将封闭做在了膜上,就必然会对产品的稳定性造成影响. 具体的影响程度要通过稳定性测试来评判.
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分. 关于膜的老化机理,有个理论支持,不过争议比较大. 理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发,使膜变得疏水,带电荷并变脆. 储存膜一般要求是避光,密封. 过干或过湿都不利. 在这种保存条件下,一般可以放置两年. 但是如果膜上做了封闭处理,就要根据具体试验情况来判断了.
有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定后方可进入调试生产.
后序
以上便是我在胶体金层析诊断试验中使用硝酸纤维素膜过程中的一些经验. 从起笔到结尾花了大约一个月时间,断断续续,终于完成. 也要感谢所有膜生产厂家技术专家在以前的工作接触中给我做过的大量技术培训,其中很多已经成为了经常联系的朋友. 由于膜工业是在不断发展的,可能出现新的问题或新的解决办法. 欢迎进行讨论。
