Western Blot 相关技术操作与原理
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（三）实验步骤
1 ．制备SDS-PAGE 凝胶
（1 ）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：
将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封
严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
（2 ）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml) ：
去离子水 5.9ml
30% 丙烯酰胺 5.0ml
1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml
10% 过硫酸胺 0.15ml
10%SDS 0.15ml
取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边
（3 ）灌制分离胶：
待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED ，混合均匀，用吸管轻轻加
入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
（4 ）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气, 有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），
室温放置约40 分钟至分离胶凝固。
（5 ）配制5% 浓缩胶4ml （此步操作可在配制分离胶时同时进行）：
去离子水 2.7ml
30% 丙烯酰胺 0.67ml
1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml
10% 过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml
10%SDS 0.04ml
TEMDE （临灌胶前再加） 0.004ml
（6 ）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯
酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。
（7 ）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5% 积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品
梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。
（8 ）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“ 凹” 面贴紧电泳槽，
两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去
除未聚合的凝胶。
2 ．样品变性及电泳
（1 ）由-80℃ 冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）
待其融化。
（2 ）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4× 蛋白
质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98℃ 变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂
离心.
（3 ）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。
（4 ）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压
约8v/cm ）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V （约12v/cm ), 继续电泳使染料至分
离胶适当位置（4℃ 冰箱中进行电泳）, 结束电泳。
3 ．注意事项
（1 ）设立必要蛋白质分子量标志物
（2 ）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积
性。故称量时应戴手套及口罩；
（3 ）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂
级别并认准使用。
（4 ）一旦加入TEMED ，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。
（5 ）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;
（6 ）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平
衡。
（7 ）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正
极方向流动。
（8 ）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5% 二氯二甲硅烷溶液，用其浸
泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲
洗多次或于180℃ 烘考2 小时。
凝胶转膜及其检测
凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物
上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC （*纤维素）膜较为常用。
本实验采用NC 膜作为固相支持物。
转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。
一、转移电泳
（一） 试剂
1 ．转移缓冲液
2 ．考马斯亮蓝快速染色液( 膜－胶10 秒钟可逆染色液 (P1601 ，MemStain)
（二）仪器及耗材
1 ．转移电泳仪
2 ．转移电泳槽
3 ．NC 膜、剪刀、滤纸等
（三）实验方法
1 ．NC 膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1× 转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保
证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）
2 ．剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；
3 ．取下电泳板，将其平置（使“ 凹” 面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉
上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1× 转膜液漂洗一次。
4 ．转膜
① 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片
→3 层滤纸→ 样品胶→NC 膜→ 三层滤纸（注意：排除气泡）→ 海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。
② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v
转膜2h （此步操作宜在4℃ 冰箱中进行）。
③ 小心取出转移膜，在1×TBST 液中漂洗两次
④ 用考马斯亮兰快速染液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全。
（四）注意事项
1. 选择合适的转移缓冲系统
2. 为避免造成以后操作误差，在转移前将膜与胶做标记；
3. 将转膜夹板的负极侧放在转移电泳槽负极侧，以确保样品蛋白由凝胶转移至NC 膜。
二．封闭、抗体孵育及曝光
（一）试剂
1 ．10×TBST 缓冲液
2 ．封闭液（5% 脱脂奶粉）
脱脂奶粉5 克 ，1×TBST 80ml, 充分溶解后补1×TBST 至100ml 。
3 ．一抗： 兔抗Actin
4 ．二抗： 羊抗兔IgG/HRP
5 ．ECL 试剂盒
6 ．显影、定影液
（二）实验仪器及材料
1 ．摇床
2 ．避光盒、洗膜用平皿、X- 光片、X- 光片曝光盒等
（三） 实验方法
1 ．封闭： 将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h （ 或4℃
过夜）；
2 ．一抗反应
① 将一抗（兔抗Actin ）用封闭液稀释500 倍；
② 将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃ 反应过夜。
3 ．洗膜
将反应膜放入平皿中，用1×TBST 漂洗一次，继而用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓
慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。
4 ．二抗反应
① 将二抗（羊抗兔IgG/HRP ） 用1×TBST 稀释2000 倍；
② 将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用50 分钟（不
超过60 分钟）。
5 ．洗膜 用1×TBST 洗膜，方法同“3” ，洗去游离二抗
6 ．曝光及洗片：
① 按1 ：1 （v/v ）混合ECL 试剂盒中两种液体。
② 将上述混合液均匀铺在NC 膜表面，室温作用2 分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有
保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC 膜（避免在膜的上面出现气泡）。
③ 在暗室中（红光下）将X 光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。
④ 将曝光后X 光片放入显影液中显影、清水中漂洗、 定影液中定影1 分钟（具体曝光
时间及显影时间需根据显影结果作出调整）。
（四）注意事项
1 ．选择合适的一抗及二抗浓度
2 ．吸取ECL 试剂时要注意更换Tip 尖； 两种试剂一经混合，应在30 分钟内使用
４．注意避光操作；
５．应考虑ECL 试剂的发光强度极其衰灭时间，两种试剂一经混合，应在规定时间内
（三）实验步骤
1 ．制备SDS-PAGE 凝胶
（1 ）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：
将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封
严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
（2 ）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml) ：
去离子水 5.9ml
30% 丙烯酰胺 5.0ml
1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml
10% 过硫酸胺 0.15ml
10%SDS 0.15ml
取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边
（3 ）灌制分离胶：
待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED ，混合均匀，用吸管轻轻加
入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
（4 ）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气, 有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），
室温放置约40 分钟至分离胶凝固。
（5 ）配制5% 浓缩胶4ml （此步操作可在配制分离胶时同时进行）：
去离子水 2.7ml
30% 丙烯酰胺 0.67ml
1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml
10% 过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml
10%SDS 0.04ml
TEMDE （临灌胶前再加） 0.004ml
（6 ）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯
酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。
（7 ）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5% 积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品
梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。
（8 ）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“ 凹” 面贴紧电泳槽，
两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去
除未聚合的凝胶。
2 ．样品变性及电泳
（1 ）由-80℃ 冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）
待其融化。
（2 ）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4× 蛋白
质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98℃ 变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂
离心.
（3 ）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。
（4 ）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压
约8v/cm ）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V （约12v/cm ), 继续电泳使染料至分
离胶适当位置（4℃ 冰箱中进行电泳）, 结束电泳。
3 ．注意事项
（1 ）设立必要蛋白质分子量标志物
（2 ）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积
性。故称量时应戴手套及口罩；
（3 ）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂
级别并认准使用。
（4 ）一旦加入TEMED ，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。
（5 ）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;
（6 ）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平
衡。
（7 ）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正
极方向流动。
（8 ）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5% 二氯二甲硅烷溶液，用其浸
泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲
洗多次或于180℃ 烘考2 小时。
凝胶转膜及其检测
凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物
上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC （*纤维素）膜较为常用。
本实验采用NC 膜作为固相支持物。
转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。
一、转移电泳
（一） 试剂
1 ．转移缓冲液
2 ．考马斯亮蓝快速染色液( 膜－胶10 秒钟可逆染色液 (P1601 ，MemStain)
（二）仪器及耗材
1 ．转移电泳仪
2 ．转移电泳槽
3 ．NC 膜、剪刀、滤纸等
（三）实验方法
1 ．NC 膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1× 转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保
证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）
2 ．剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；
3 ．取下电泳板，将其平置（使“ 凹” 面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉
上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1× 转膜液漂洗一次。
4 ．转膜
① 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片
→3 层滤纸→ 样品胶→NC 膜→ 三层滤纸（注意：排除气泡）→ 海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。
② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v
转膜2h （此步操作宜在4℃ 冰箱中进行）。
③ 小心取出转移膜，在1×TBST 液中漂洗两次
④ 用考马斯亮兰快速染液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全。
（四）注意事项
1. 选择合适的转移缓冲系统
2. 为避免造成以后操作误差，在转移前将膜与胶做标记；
3. 将转膜夹板的负极侧放在转移电泳槽负极侧，以确保样品蛋白由凝胶转移至NC 膜。
二．封闭、抗体孵育及曝光
（一）试剂
1 ．10×TBST 缓冲液
2 ．封闭液（5% 脱脂奶粉）
脱脂奶粉5 克 ，1×TBST 80ml, 充分溶解后补1×TBST 至100ml 。
3 ．一抗： 兔抗Actin
4 ．二抗： 羊抗兔IgG/HRP
5 ．ECL 试剂盒
6 ．显影、定影液
（二）实验仪器及材料
1 ．摇床
2 ．避光盒、洗膜用平皿、X- 光片、X- 光片曝光盒等
（三） 实验方法
1 ．封闭： 将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h （ 或4℃
过夜）；
2 ．一抗反应
① 将一抗（兔抗Actin ）用封闭液稀释500 倍；
② 将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃ 反应过夜。
3 ．洗膜
将反应膜放入平皿中，用1×TBST 漂洗一次，继而用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓
慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。
4 ．二抗反应
① 将二抗（羊抗兔IgG/HRP ） 用1×TBST 稀释2000 倍；
② 将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用50 分钟（不
超过60 分钟）。
5 ．洗膜 用1×TBST 洗膜，方法同“3” ，洗去游离二抗
6 ．曝光及洗片：
① 按1 ：1 （v/v ）混合ECL 试剂盒中两种液体。
② 将上述混合液均匀铺在NC 膜表面，室温作用2 分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有
保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC 膜（避免在膜的上面出现气泡）。
③ 在暗室中（红光下）将X 光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。
④ 将曝光后X 光片放入显影液中显影、清水中漂洗、 定影液中定影1 分钟（具体曝光
时间及显影时间需根据显影结果作出调整）。
（四）注意事项
1 ．选择合适的一抗及二抗浓度
2 ．吸取ECL 试剂时要注意更换Tip 尖； 两种试剂一经混合，应在30 分钟内使用
４．注意避光操作；
５．应考虑ECL 试剂的发光强度极其衰灭时间，两种试剂一经混合，应在规定时间内
1 ．制备SDS-PAGE 凝胶
（1 ）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：
将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封
严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
（2 ）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml) ：
去离子水 5.9ml
30% 丙烯酰胺 5.0ml
1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml
10% 过硫酸胺 0.15ml
10%SDS 0.15ml
取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边
（3 ）灌制分离胶：
待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED ，混合均匀，用吸管轻轻加
入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
（4 ）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气, 有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），
室温放置约40 分钟至分离胶凝固。
（5 ）配制5% 浓缩胶4ml （此步操作可在配制分离胶时同时进行）：
去离子水 2.7ml
30% 丙烯酰胺 0.67ml
1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml
10% 过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml
10%SDS 0.04ml
TEMDE （临灌胶前再加） 0.004ml
（6 ）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯
酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。
（7 ）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5% 积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品
梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。
（8 ）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“ 凹” 面贴紧电泳槽，
两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去
除未聚合的凝胶。
2 ．样品变性及电泳
（1 ）由-80℃ 冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）
待其融化。
（2 ）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4× 蛋白
质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98℃ 变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂
离心.
（3 ）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。
（4 ）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压
约8v/cm ）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V （约12v/cm ), 继续电泳使染料至分
离胶适当位置（4℃ 冰箱中进行电泳）, 结束电泳。
3 ．注意事项
（1 ）设立必要蛋白质分子量标志物
（2 ）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积
性。故称量时应戴手套及口罩；
（3 ）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂
级别并认准使用。
（4 ）一旦加入TEMED ，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。
（5 ）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;
（6 ）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平
衡。
（7 ）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正
极方向流动。
（8 ）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5% 二氯二甲硅烷溶液，用其浸
泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲
洗多次或于180℃ 烘考2 小时。
凝胶转膜及其检测
凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物
上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC （*纤维素）膜较为常用。
本实验采用NC 膜作为固相支持物。
转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。
一、转移电泳
（一） 试剂
1 ．转移缓冲液
2 ．考马斯亮蓝快速染色液( 膜－胶10 秒钟可逆染色液 (P1601 ，MemStain)
（二）仪器及耗材
1 ．转移电泳仪
2 ．转移电泳槽
3 ．NC 膜、剪刀、滤纸等
（三）实验方法
1 ．NC 膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1× 转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保
证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）
2 ．剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；
3 ．取下电泳板，将其平置（使“ 凹” 面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉
上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1× 转膜液漂洗一次。
4 ．转膜
① 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片
→3 层滤纸→ 样品胶→NC 膜→ 三层滤纸（注意：排除气泡）→ 海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。
② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v
转膜2h （此步操作宜在4℃ 冰箱中进行）。
③ 小心取出转移膜，在1×TBST 液中漂洗两次
④ 用考马斯亮兰快速染液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全。
（四）注意事项
1. 选择合适的转移缓冲系统
2. 为避免造成以后操作误差，在转移前将膜与胶做标记；
3. 将转膜夹板的负极侧放在转移电泳槽负极侧，以确保样品蛋白由凝胶转移至NC 膜。
二．封闭、抗体孵育及曝光
（一）试剂
1 ．10×TBST 缓冲液
2 ．封闭液（5% 脱脂奶粉）
| 封闭专用脱脂奶粉 |
| 膜快速封闭液 |
3 ．一抗： 兔抗Actin
4 ．二抗： 羊抗兔IgG/HRP
5 ．ECL 试剂盒
|
|||||
| D72 显影粉 |
| D72 定影粉 |
1 ．摇床
2 ．避光盒、洗膜用平皿、X- 光片、X- 光片曝光盒等
|
（三） 实验方法
1 ．封闭： 将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h （ 或4℃
过夜）；
2 ．一抗反应
① 将一抗（兔抗Actin ）用封闭液稀释500 倍；
② 将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃ 反应过夜。
3 ．洗膜
将反应膜放入平皿中，用1×TBST 漂洗一次，继而用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓
慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。
4 ．二抗反应
① 将二抗（羊抗兔IgG/HRP ） 用1×TBST 稀释2000 倍；
② 将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用50 分钟（不
超过60 分钟）。
5 ．洗膜 用1×TBST 洗膜，方法同“3” ，洗去游离二抗
6 ．曝光及洗片：
① 按1 ：1 （v/v ）混合ECL 试剂盒中两种液体。
② 将上述混合液均匀铺在NC 膜表面，室温作用2 分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有
保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC 膜（避免在膜的上面出现气泡）。
③ 在暗室中（红光下）将X 光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。
④ 将曝光后X 光片放入显影液中显影、清水中漂洗、 定影液中定影1 分钟（具体曝光
时间及显影时间需根据显影结果作出调整）。
（四）注意事项
1 ．选择合适的一抗及二抗浓度
2 ．吸取ECL 试剂时要注意更换Tip 尖； 两种试剂一经混合，应在30 分钟内使用
４．注意避光操作；
５．应考虑ECL 试剂的发光强度极其衰灭时间，两种试剂一经混合，应在规定时间内
（三）实验步骤
1 ．制备SDS-PAGE 凝胶
（1 ）准备SDS-PAGE 凝胶用玻璃槽：
将两条垫片放入两块特制玻璃板中间（其中一块为凹形），用透明胶带将两边及底边封
严。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。
（2 ）配制10%SDS-PAGE 分离胶 (15ml) ：
去离子水 5.9ml
30% 丙烯酰胺 5.0ml
1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml
10% 过硫酸胺 0.15ml
10%SDS 0.15ml
取上述液体1ml, 加入TEMED 3ul, 混匀后用其封凝胶用玻璃槽周边
（3 ）灌制分离胶：
待封边胶凝固后，在其余14ml 分离胶液中加入7 ul TEMED ，混合均匀，用吸管轻轻加
入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。
（4 ）立即用0.1%SDS 液覆盖胶面（隔绝空气, 有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），
室温放置约40 分钟至分离胶凝固。
（5 ）配制5% 浓缩胶4ml （此步操作可在配制分离胶时同时进行）：
去离子水 2.7ml
30% 丙烯酰胺 0.67ml
1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.5ml
10% 过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml
10%SDS 0.04ml
TEMDE （临灌胶前再加） 0.004ml
（6 ）倒掉0.1%SDS 覆盖液，用去离子水冲洗分离胶表面3-4 次，以洗净未聚合的丙烯
酰胺凝胶（避免在胶顶部或玻璃夹板中留有气泡），并用吸水纸吸掉残留的液体。
（7 ）将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5% 积层胶液（注意避免产生气泡），插入样品
梳，使液面至样品梳上标志线位置， 室温凝胶约40 分钟。
（8 ）轻轻拔去梳子，撕去封玻璃夹板用透明胶带，将玻璃夹板“ 凹” 面贴紧电泳槽，
两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。用针头式注射器吸取电泳缓冲液轻轻冲洗点样孔，以去
除未聚合的凝胶。
2 ．样品变性及电泳
（1 ）由-80℃ 冰箱取出提取的Hela 细胞总蛋白样品，立即插入冰中（减少蛋白降解）
待其融化。
（2 ）吸取细胞总蛋白样品15ul 加入0.5mlEP 管中, 每样品管中分别加入5ul 4× 蛋白
质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，98℃ 变性5 分钟，立即插入冰中，voltex 数秒，短暂
离心.
（3 ）吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。
（4 ）将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V 使样品通过浓缩胶（电压
约8v/cm ）。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V （约12v/cm ), 继续电泳使染料至分
离胶适当位置（4℃ 冰箱中进行电泳）, 结束电泳。
3 ．注意事项
（1 ）设立必要蛋白质分子量标志物
（2 ）丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积
性。故称量时应戴手套及口罩；
（3 ）不同厂家的SDS 可引起多肽的迁移图谱变化较大，建议找出个人喜欢的某一试剂
级别并认准使用。
（4 ）一旦加入TEMED ，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹板。
（5 ）过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制;
（6 ）在多余的样品孔中加入适量的蛋白质电泳上样液， 将会有助于保持电泳系统的平
衡。
（7 ）正确连接电泳连线正、负极方向（负极在上，正极在下）以保证电荷由负极向正
极方向流动。
（8 ）凝胶玻璃板要定期做硅化处理: 用氯仿或庚烷配成5% 二氯二甲硅烷溶液，用其浸
泡或擦拭玻璃板，有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲
洗多次或于180℃ 烘考2 小时。
凝胶转膜及其检测
凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物
上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。
用于Western 印迹法的固相支持物有多种，NC （*纤维素）膜较为常用。
本实验采用NC 膜作为固相支持物。
转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。
一、转移电泳
（一） 试剂
1 ．转移缓冲液
2 ．考马斯亮蓝快速染色液( 膜－胶10 秒钟可逆染色液 (P1601 ，MemStain)
（二）仪器及耗材
1 ．转移电泳仪
2 ．转移电泳槽
3 ．NC 膜、剪刀、滤纸等
（三）实验方法
1 ．NC 膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC 膜，将其浸入1× 转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保
证NC 膜始终完全浸于转移缓冲液中）
2 ．剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；
3 ．取下电泳板，将其平置（使“ 凹” 面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉
上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用1× 转膜液漂洗一次。
4 ．转膜
① 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片
→3 层滤纸→ 样品胶→NC 膜→ 三层滤纸（注意：排除气泡）→ 海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。
② 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下，80v
转膜2h （此步操作宜在4℃ 冰箱中进行）。
③ 小心取出转移膜，在1×TBST 液中漂洗两次
④ 用考马斯亮兰快速染液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全。
（四）注意事项
1. 选择合适的转移缓冲系统
2. 为避免造成以后操作误差，在转移前将膜与胶做标记；
3. 将转膜夹板的负极侧放在转移电泳槽负极侧，以确保样品蛋白由凝胶转移至NC 膜。
二．封闭、抗体孵育及曝光
（一）试剂
1 ．10×TBST 缓冲液
2 ．封闭液（5% 脱脂奶粉）
| 封闭专用脱脂奶粉 |
| 膜快速封闭液 |
3 ．一抗： 兔抗Actin
4 ．二抗： 羊抗兔IgG/HRP
5 ．ECL 试剂盒
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| D72 显影粉 |
| D72 定影粉 |
1 ．摇床
2 ．避光盒、洗膜用平皿、X- 光片、X- 光片曝光盒等
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（三） 实验方法
1 ．封闭： 将转移后的膜放入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭1h （ 或4℃
过夜）；
2 ．一抗反应
① 将一抗（兔抗Actin ）用封闭液稀释500 倍；
② 将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃ 反应过夜。
3 ．洗膜
将反应膜放入平皿中，用1×TBST 漂洗一次，继而用1× TBST 洗涤三次，（室温下缓
慢摇动洗涤）每次10 分钟，洗净未结合的一抗。
4 ．二抗反应
① 将二抗（羊抗兔IgG/HRP ） 用1×TBST 稀释2000 倍；
② 将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中（室温、避光缓慢摇动）作用50 分钟（不
超过60 分钟）。
5 ．洗膜 用1×TBST 洗膜，方法同“3” ，洗去游离二抗
6 ．曝光及洗片：
① 按1 ：1 （v/v ）混合ECL 试剂盒中两种液体。
② 将上述混合液均匀铺在NC 膜表面，室温作用2 分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有
保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC 膜（避免在膜的上面出现气泡）。
③ 在暗室中（红光下）将X 光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。
④ 将曝光后X 光片放入显影液中显影、清水中漂洗、 定影液中定影1 分钟（具体曝光
时间及显影时间需根据显影结果作出调整）。
（四）注意事项
1 ．选择合适的一抗及二抗浓度
2 ．吸取ECL 试剂时要注意更换Tip 尖； 两种试剂一经混合，应在30 分钟内使用
４．注意避光操作；
５．应考虑ECL 试剂的发光强度极其衰灭时间，两种试剂一经混合，应在规定时间内
