• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        酵母双杂交实验常见疑难解答

        互联网

        989

        问:如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,该怎么办?

        答:在有些情况下,在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。重悬克隆于1ml的SD/�Trp,接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/�Trp平板。在30℃下温浴,直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆,并收集到一管中。接着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

        问:我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达,该如何处理?

        答:该蛋白很可能有转录激活域,是个转录因子。这可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活。但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

        问:转化效率太低,怎么办?
        答:1. 检测一下DNA的纯度,如果可以的话,重新用乙醇纯化。
        2. DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
        3. 不适当的培养基,重新配制培养基,并做对照转化。
        4. 检测pGBT9对照载体的转化效率,放置于SD/�Trp平板上,转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。

        问:杂交效率不高,该如何处理?
        答:在杂交中,预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的,新鲜的克隆进行培养。经过离心和重悬后,使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109 /ml。
            一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性,同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。


         

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序