酵母质粒提取及转化大肠杆菌的问题

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完美酵母质粒提取实验Protocol

问: 想从酵母提取质粒 ,转化大肠杆菌,按分子克隆的方法,可能都线性化了,转化率为0,请问有什么好的办法?

答: 以下是我的方法,曾提过数百个,好像转化效率还可以,基本上都提出来了.

个人体会是Lyticase的活性要好,而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧,u see,酵母质粒所以不好提,就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁,再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题,所以破壁一定要充分.其次吗?感受态细胞 的状态也会有很大的影响……再有,如果担心酵母细胞的活性问题,也可以活化一下再提,不过好象我的实验中这项不是问题.......哈哈….

详细步骤:

1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管 中.

2、每管加10μl的裂解液(Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存),涡流混匀.

3、37℃,200-250r/m,30-60min.

4、每管加10 μl 20%SDS,涡流1min.

5、–20℃冻存过夜.

6、室温下融解后,涡流混匀.

7、质粒提取.

7.1 1.5ml离心管加TE Buf至200μl的(pH7.0)

7.2 200μl酚,涡流5min后,4℃,14000r/m离心10min.

7.3 取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中.

7.4 等体积酚氯仿,涡流5min.

7.5 4℃,14000r/m离心10min.

7.6 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿,涡流混匀.

7.7 4℃,14000r/m离心10min.

7.8 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中.

7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95%～100%的乙醇.

7.10 –70℃,1h.

7.11 4℃,14000r/m离心10min.

7.12 弃上清,空气中干燥.

7.13 10μl H2O悬浮细胞.

8、转化(要求:4℃预冷)

8.1 冰上融化感受态细胞(感受态细胞的制备见分子克隆啦)Top10f’.

8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中,枪头轻轻吹打混匀.

8.3 冰上孵育30min.

8.4 42℃,45S～50S.

8.5 冰上孵育2min后,加1ml LB.

8.6 37℃,1h,250r/m.

8.7 2500r/m,5min,RT.

8.8 弃上清,在剩余的溶液中悬细胞.

8.9 接种LB/Amp板,37℃,倒置培养24h.

8.10 挑克隆,过夜培养,常规碱裂解法提质粒