离子交换层析纯化超氧化物歧化酶

相关专题

离子交换层析技术专题 蛋白纯化技术专题

本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质,在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白,进而除去杂蛋白.实验中选用DE-32离子交换纤维素.相关原理请参见实验教材中离子交换层析 一章.

[试剂和器材]

1、试剂

(1)DE-32

(2)缓冲液Ⅰ：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4(pH7.6)

(3)缓冲液Ⅱ：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4(pH7.6)

2、器材

(1)层析柱 (2.5cm × 25cm)

(2)部分收集器

(3)梯度洗脱仪

(4)紫外分光光度计

(5)试管、透析袋

[方法和步骤]

1、DEAE-纤维素的预处理：

(1)称取5gDE-32,撒在盛有75ml 0.5mol/L HCl的烧杯中,室温放置30min,不时轻轻搅拌.

(2)将糊状物移入3号砂芯漏斗中,用蒸馏水淋洗.如此重复,每加一次去离子水,浸泡一段时间,再进行抽滤,至洗涤液pH等于4即可(pH试纸试).

(3)将糊状物移入烧杯中,加入75ml 0.5mol/L NaOH,放置30min,不时轻轻搅拌,弃去上清液,依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次.

(4)将交换剂移入3号砂芯漏斗中,反复用去离子水淋洗,直至洗涤液pH为8.0(可用pH试纸测试).

(5)将DEAE-纤维素浸泡在150ml去离子水中.用0.5mol/L 盐酸把pH调至7.6,滴定可在pH计上进行,须使悬液最终pH在10min内无变化,然后抽滤.

(6)将上述滤块置于100毫升量筒中,加入75ml缓冲液I,慢慢搅混之后,静置20min,用倾斜法除去上清液中细微粒子,如此重复若干次,最后上清液pH与缓冲液I几乎一致.

2、装柱

(1)层析柱用洗涤液洗清洁,柱的下端联接塑料管,装上螺旋夹.关上螺旋夹,柱内装入缓冲液I,微开螺旋夹.让缓冲液缓慢流出,赶走死区及塑料管中的气泡,柱中保留少量缓冲液,关闭螺旋夹.

(2)将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液(约有1倍体积的缓冲液I)放在抽滤瓶中减压除尽气泡,然后沿管壁倒人柱中,待沉降至床高约1cm高度时,部分旋松螺旋夹,让溶液缓慢流出去,注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢,陆续加入较多的浆液,直至达到高10cm以上的柱床体积.

3、平衡当全部交换剂装入柱中后,用上柱起始缓冲液进行平衡.流速可维持在4ml/15min,直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同.(一般要平衡8h以上或过夜.)

4、层析用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体,打开出口使缓冲液Ⅰ恰流到表面,关闭出口.用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液,打开出口,使样品溶液进入纤维素内,至几乎露出床面时,柱壁用少量缓冲液小心洗涤2～3次,然后装入缓冲液Ⅰ,使液面高出创面2～3 cm左右.

5、洗脱

(1)按图将梯度洗脱器和层析柱连接好.

(2)在洗脱瓶A(贮存器)和洗脱瓶B(混合器)内各装入100ml缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ,注意两洗脱瓶,特别是液面应处于同一水平面,同时应排除连接管内气泡.

(3)开动电磁搅拌器开关,调节搅拌速度,以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜.

(4)将两瓶和柱上下连接管道打开,开始收集洗脱流出液,控制流速在1.5ml/min.收集液测定蛋白质浓度和酶活性.

(5)收集合并具有SOD活性部分的洗脱液,透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD(淡蓝绿色产品).