体外抗体形成细胞检测——液相小室法
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一、基本原理
溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cell, PFC）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原 抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
二、实验材料
1. 解剖器械、试管、1ml吸量管
2. 载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器
3. ICR小鼠（北京大学 医学部实验动物中心提供）
4. 5％和10％绵羊红血球（SRBC）
5. 补体(豚鼠血清，经SRBC吸收，临用时稀释成合适浓度)
三、实验方法
1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备：
将5％SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔，4天后拉脱颈椎处死，取出脾脏放在已加入6ml Hank’s液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨，过滤混匀，从中吸取lml加入试管中，加满Hank’s液混匀，离心1000rpm，10分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积，即为约107／ml浓度的细胞悬液。
2．制作小室：
取无脂载玻片（75mm×25mm）, 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边（无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准）。
2. 小室灌注细胞悬液：
取107／ml脾细胞悬液100ml
10％SRBC 200ml
补体 200ml
Hank’s液 1m1
混匀后，用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37℃孵箱30—45分钟。
四、实验结果
观察小室内的透明空斑，一个空斑即代表一个空斑形成细胞（PFC），即B细胞。
五、注意事项
（1） 小室注入液体时不要留有气泡。
（2） 小室边缘需用石蜡封严。
（3） 37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜。
（1） 观察结果时，应注意辨别空斑与气泡的区别，避免将气泡误认为溶血空斑。
