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        细胞计数和存活测试

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        1. 原理:
        1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
        1.2. 血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形,其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格,深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml 中之细胞数目。
        1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜 完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。
        2. 材料:
        2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
        2.2. Erythosin bluish stain
        取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
        paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
        2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)
        2.4. 计数器(counter)
        2.5. 低倍倒立显微镜
        2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
        3. 步骤:
        3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。
        3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100 倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。
        3.3. 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blue 等体积混合),最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
        4 大格细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
        ~undefined每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
        3.4. 若不用血球计数盘,可用Coulter counter 作自动计数,惟无法辨别死细胞或活细胞。
        3.5. 范例:
        T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液,取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。
        活细胞数/方格:55 ,62, 49, 59
        死细胞数/方格:5, 3, 4, 6
        细胞总数= 243
        平均细胞数/方格= 60.75
        稀释倍数= 2
        细胞数/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
        细胞数/flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
        存活率:225/243﹦92.6 %
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