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        细胞爬片中重点注意事项

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        第一,盖玻片需要过酸,并且自来水、蒸馏水冲洗干净。两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起,很容易冲不干净,很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张,一定要看清楚,晾干片子最好是在消毒饭盒中进行,饭盒底面放上纱布,将玻片斜靠在饭盒侧壁,玻片正面不要接触纱布,否则会粘上毛毛的。然后高压蒸汽灭菌,烤箱中烤干。

        第二,爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片,未处理过的细胞不容易贴壁,细胞系还好,原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要,否则在后面用PBS 洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后,放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍!层粘蛋白和胶原还好,多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。

        第三,传代消化下来的细胞一定不要过多稀释,将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上,几个小时后再追加培养基。

        第四,玻片在培养皿中容易漂起,如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来,或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的,这时背面的细胞必须去除,挺难操作的,用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞,用小镊子夹玻片很容易夹碎,也很容易脱落,小心点好。

        第五,将玻片拿出后一定要记好哪边是正面,最好做玻片时将玻片切成长方形的。目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片,或者24mmx24mm的盖玻片,正方形,很难分辨反正面,在某个角上打个缺口,对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改成长方形,至于在某个角上用砂轮做个标记,理论上很简单,实际操作有难度。

        第六,上面步骤都没问题后,玻片就需要进一步处理了,这里有几个细节,分述如下:

        1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡,我个人认为浸泡好,我吃过冲洗的亏,每一步后都要冲洗2-3次,有时还没等试验做完,大部分细胞已经被冲掉了,呵呵!我当时欲哭无泪啊!

        2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少,有人认为4°C的好,有人认为37°C的好,我个人感觉,娇贵的原代细胞先在常温下固定较好,然后放到4°C冰箱中。我发现直接用4°C的溶液会造成细胞冷休克,从片上脱落。

        3.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时,尽量少滴树胶,一点点就够了,而且至少半个小时以上才能粘牢,防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动,背面会出现树胶的印子,镜下很难看,而且擦不掉的。

        4.固定好的片子放到冰箱中保存,我倒没怎么试过,我基本上做好的就直接做免疫组化

        补充说明:盖玻片有两种材质的:一种是塑料的,一种是玻璃的,建议用玻璃的,因与confocol兼容。封片可以用专用的mounting solution,可防止荧光淬灭。

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