冷冻蚀刻技术概述及应用

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冷冻蚀刻(Freezeetching)技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，故而亦称冷冻断裂(Freezefracture)或冷冻复型(Freezereplica)。

一、优点

①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态;

②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构;

③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。

二、缺点

冷冻也可造成样品的人为损伤;断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。

三、装置型号

<center> <img alt="冷冻蚀刻技术概述及应用" height="195" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591590.jpg" width="300" /></center>

装置图

目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如EIKO公司生产的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生产的BAF300型;另一种是真空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的HFZ1型，它与FE1型加温蚀刻装置一起安装在HUS5型真空喷镀仪中使用。以上两种类型各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连续制样，效率高。缺点是价格贵;附件装置价格虽便宜，但不能连续操作，效率低。

四、操作方法

冷冻蚀刻的操作方法按以下步骤进行。

<center> <img alt="冷冻蚀刻技术概述及应用" height="204" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591589.jpg" width="300" /></center>

显微图像

1.预处理取新鲜组织块，大小为15～3～5mm，用25%戊二醛固定1～3小时。为防止冰晶形成，用30%甘油生理盐水浸泡8～12小时。

2.冷冻断裂是在冷冻条件下使样品变得又硬又脆，用刀劈裂样品，暴露观察面。因为是用刀劈裂的样品，断裂往往发生在细胞被冻结后较脆弱的部位，多数是沿细胞及细胞器 的膜裂开。由于断裂面是凸凹不平的，所以图像立体感强。冷冻断裂时，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必锋利，但不能有缺口、油污和水份，还需保持清洁干燥。冷冻复型的断裂操作要在真空中进行，是因为真空对热传导性差，能使样品较长时间维持在较恒定温度下进行断裂操作，同时也便于进行下步的蚀刻处理。仪器中进行断裂的最佳条件：真空度为133×10-5～3×40-3Pa(1×10-5～3×10-5Torr)，样品升温至-100℃～-110℃。

3.蚀刻就是在真空中使冷冻样品表面上的冰升华。目的是为了暴露出样品断裂面上的超微结构，便于喷镀。一般认为最佳蚀刻深度约为30nm。若蚀刻深度不够，结构被冰掩盖不能充分暴露出来，图像模糊;若蚀刻深度过大，超微结构因其基础支持不足而倒塌，从而破坏了超微结构。蚀刻深度是由蚀刻速度和蚀刻时间决定的，而蚀刻速度是受真空度、温度、水蒸汽压所影响。一般蚀刻条件：真空度为133×10-3～133×10-4Pa(10-5～10-6　Torr)，温度降至-100℃，在此条件下，蚀刻速度大约为2nm/s。

4.喷镀即在样品断裂面上喷镀一层铂膜及碳膜。铂膜厚度为2～5nm。为使图像具有立体感，喷铂的方向与样品成45度角。为加固铂膜强度，再喷镀一层碳，喷碳的方向与样品面成90度角。

5.剥离清洗喷镀后，将样品取出放入10～30%次氯酸钠腐蚀液中，样品渐冒气泡并与复型膜分离。随后用蒸馏水仔细清洗复型膜。

6.捞膜将清洗后的复型膜捞在不加支持膜的400目载网上，待干后电镜观察。

五、应用

1.冷冻蚀刻表面标记免疫 电镜技术

(1)新鲜或固定的细胞进行直接法或间接法免疫 标记。

(2)PBS (pH7.5)冲洗3min×2，加入1mmol/l MgCl2蒸馏水洗洗3min×3，离心沉集细胞。

(3)将细胞团置于小纸板上，入液氮冷却的Freon中，取出入冷冻蚀刻仪中进行断裂操作，再于-100℃蚀刻1min 。

(4)制做断裂面复型。

(5)再次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗后进行观察。

本法可显示断裂暴露的PF位于中央，周围则是蚀刻后露出来的ES，标记物只出现在ES上。

2.断裂—标记免疫 电镜技术

此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记，从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。

(1)临界点干燥法

①固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS冲洗3min×3。

如为细胞悬液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝胶化，将凝胶切成2mm左右的小块，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。

②冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中，培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。

③解冻，置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。

④置换甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS冲洗，3min×2。

⑤免疫标记。

⑥1%锇酸，室温固定30min。

⑦系列梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷镀铂—碳膜，次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗，捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。

(2)超薄切片法

步骤：①至⑤同临界点干燥法。

⑥1%锇酸，室温固定2h，系列酒精或丙酮脱水，常规电镜包埋。

⑦切半薄片，光镜定位合适的断裂部位，再切超薄切片，铀铅染色，透射电镜观察。

断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术，常用的如刀豆球蛋白(Con A)-- 胶体金免疫标记技术.Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合，能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。

为保证实验结果的准确性，每组实验在免疫标记阶段应设立对照组。对照组的设计同第一章　总论中的免疫对照染色。