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        噬菌体滴度的测定的方法

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        在宿主细胞过量的情况下,噬斑的数量随着噬菌体的增加呈线性增加。由于这个原因,在感染以前,要将噬菌体进行稀释,而不是将宿主细胞稀释。以低MOI(感染重复性)铺板,也可确保每一个噬斑仅包含一个DNA序列。


        材料和试剂

        1.  微波炉

        2.  LB/IPTG/Xgal培养板

        3.  LB培养基

        4.  顶层琼脂糖凝胶

        操作步骤

        1.  在5~10 ml LB培养基中接种单个ER2537克隆,振摇孵育直至对数生长中期(OD600~0.5)

        2.  在细胞生长时,微波融化顶层琼脂糖凝胶,分装至无菌培养管内,每管3 ml。维持在45 ℃备用。

        3.  37 ℃预热LB/IPTG/Xgal培养板,备用。

        4.  以LB培养基10倍比稀释噬菌体。

        建议稀释范围:对扩增的噬菌体培养上清,108-1011;对未扩增的筛选洗脱液,101-104。每次稀释都换用新的加样枪头,最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。

        5.  一旦ER2537培养物长至对数生长中期,分装至微量离心管中,每管200 ml。

        6.  将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中,一支微量离心管中仅加入一种稀释液10 ml,快速涡旋,室温孵育1-5 min。

        7.  转移至含有45 ℃顶层琼脂糖凝胶的管中,快速涡旋混匀,立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上,轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。

        8.  冷却平板5 min,37 ℃倒置培养过夜。

        9.  噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准,噬斑数乘以稀释度即可获得每10 ml噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。

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