Northern杂交实验指导之二：RNA质量检测

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二、RNA质量检测

提取的RNA需要对其质量和数量进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。

方法一、紫外吸收检测

试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA )。

dH2O

试验程序

1.预热紫外分光光度计 10～20min.。

2.取两个1ml的狭缝石英杯，一个装入1mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。

3.取4μl RNA待测样品加入另一比色杯中，加dH2O至1ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。

4.将两个比色杯置于分光光度计 中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。

RNA浓度和纯度分析

浓度计算：对于单链RNA，OD260=1.0时，RNA浓度为40μg/ml，按照上述稀释方式，即OD260=0.1时，其RNA浓度为1μg/ml。

纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.7~2.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染;OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子 及盐类污染。

方法二、变性琼脂 糖凝胶电泳检测

试剂及其配制

MOPS缓冲液(10×): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA

准确称取41.86g MOPS, 6.8g NaAc, 3.72g EDTA，先用适量的用DEPC处理的水溶解NaAc，再将MOPS溶解其中，再加入已用同样方法处理水溶解的EDTA，混匀后用2mol/Ld NaOH将调整pH 至7.0，最后定溶至1000ml，过滤灭菌后避光保存。

上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝

其它试剂：甲醛(37%溶液，13.3mol/L)

甲酰胺(去离子)

将10ml甲酰胺和1g离子交换树脂混合，室温搅拌1 小时后用Whatman滤纸过滤。等分成1ml于-70℃贮存。

溴化乙锭(EB，10mg/ml)

70%乙醇

试验程序

1.将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

2.配制琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热溶化均匀。

3.待胶凉至60~70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10×MOPS缓冲液和0.5μl溴化乙锭，混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。

4.样品制备：取DEPC处理过的500μl小离心管，依次加入10×MOPS缓冲液2μl、甲醛3.5μl、甲酰胺(去离子)10μl、RNA样品4.5μl，混合均匀;将离心管置于60℃水浴中保温10min.，再置于冰上2min.;向每管中加入3μl上样染料，混匀。

5.上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极)，加入电泳缓冲液(1×MOPS缓冲液)，液面高出胶面1～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40μl。

6.电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳2小时左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。

RNA样品质量分析：

完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。

植物总RNA中28S rRNA及18S rRNA在变性胶上的迁移率相当于分子量5.1kb及2.0kb RNA的迁移率，以此可作为分子量的参考。