真核细胞基因的转染方法

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【1】．DEAE－葡聚糖法
一、实验材料：
1．50mg/ml DEAE-葡聚糖溶液（500mg DEAE-葡聚糖溶于10ml水，1ml分装，高压灭菌，储存于-20℃） （Sigma）
2．TBS溶液(PH 7.4)
NaCL 8.0g/L
KCL 0.2g/L
Tris 3.0g/L
酚红 0.015g/L
(HCL调PH至7.4，定容1L。高压灭菌。)
3．20％葡萄糖溶液(高压灭菌，-20℃储存)
4．PBS (PH 7.4)
二、实验方法：
1．配置TBS-D溶液
100mlTBS加入20％葡萄糖溶液0.5ml，至终浓度为1％。
2．配置DEAE-dextran-DNA-TBS-D转染 液
DEAE-dextran 1mg/ml
DNA(超螺旋) 5-10ug/ml(DNA浓度根据细胞种类、细胞密度及质粒 种类决定，最适浓度经预实验确定)
转染 液数量根据细胞多少决定，一般每瓶细胞需300ul。
3．以5×105/瓶密度接种细胞，培养24小时。
4．细胞弃培养基, PBS 5ml洗两遍, TBS-D洗一遍，吸尽残液。
5．加入转染液，摇动培养瓶，使其与细胞充分接触，放入孵箱温育20－40分钟，观察细胞至皱缩变圆为止。
6．吸去转染液，TBS-D洗两遍, PBS洗一遍（动作必须轻柔，避免已转染DNA的细胞脱落），加入10ml全培养基 3％CO2浓度37℃培养。
三．实验结果鉴定标准：
1．转染有DNA的细胞一般镜下观察颗粒较多，加入抗生素筛选培养，可使未转染DNA的细胞死亡。
2．如目的DNA为pZ189，可通过Hirt’s法提取，做转化鉴定。
3．加入氯喹作用或进行甘油休克可增加转染效率。
四．参考文献：
1．Sambrook J et al. Molecular cloning.
2．张小山，浙江医科大学研究生学位论文。