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        基因重组中不可不知的知识点精简概括

        相关方法:基因重组—层析法

        互联网

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        以下,你将看到的是基因工程中不可不知的知识点精简概要。基因重组 学什么?我觉得吧,基本概念、实验方法、在基因工程中的位置、与其他实验的关联、用途等等要清楚。如果您对这一技术了解不太明晰,这里一点那里一点的,建议看看。

        一、重组 DNA技术相关概念

        (一)DNA克隆

        克隆 (clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

        克隆 化(cloning):获取同一拷贝的过程,即无性繁殖。

        1.分子克隆(DNA克隆)

        2.细胞克隆

        3.个体克隆(动物或植物)

        DNA克隆:

        应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。

        基因工程:

        实现基因克隆所采用的方法及相关的工作,又称为重组DNA技术 (recom-binant DNA technology)。

        (二)工具酶

        1.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)

        识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。

        限制性核酸内切酶作用后产生两种末端:钝性末端(blunt end)粘性末端(sticky end)

        限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端(compatible end),可用连接酶连接。

        2.DNA聚合酶I

        3.逆转录酶

        4.DNA连接酶

        5.碱性磷酸酶

        6.末端转移酶

        7.Taq DNA聚合酶

        (三)目的基因

        应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。

        1.cDNA(complementary DNA):是指经反转录合成的,与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。

        2.基因组DNA(genomic DNA):是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

        (四)基因载体(vector)

        能携带目的基因,实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。

        常用的载体:质粒、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准: 能自主复制;

        具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定;

        有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;

        分子量小,以容纳较大的外源DNA。

        1.质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数 千碱基对。常有 1 ~ 3个抗药性 基因,以利于筛 选。

        2.噬菌体(phage)DNA

        λ 噬菌体DNA改造系统

        λ gt 系列(插入型,适用cDNA克隆)

        EMBL系列(置换型,适用基因组克隆)

        M13噬菌体DNA改造系统(含lac Z基因)

        M13mp系列

        pUC系列

        3.其他

        柯斯质粒(cosmid)

        酵母人工染色体载体(yeast artificial chromosome,YAC)

        细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)

        动物病毒DNA改造的载体(如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒)

        二、重组DNA技术基本原理

        (一)目的基因的获取

        1.化学合成法:用于已知序列,或可推导出序列的基因

        2.基因组DNA

        基因组DNA文库(genomic DNA library):存在于转化细菌内,由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G-文库。

        3.cDNA:

        cDNA文库(cDNA library)用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后,建立的基因文库。简称 c-文库。

        4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)

        PCR是根据DNA复制的原理,在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。

        PCR的反应体系:模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2++的缓冲液。

        PCR的基本反应步骤:

        1.变性:将反应系统加热至95℃ ,使模板DNA完全变性成为单链;

        2.退火:将温度下降至50℃左右,使引物与模板DNA退火结合;

        3.延伸:将温度升至72℃ ,DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。

        上述三个步骤为一个循环,经25~30次循环后,可将模板DNA扩增达百万倍。

        (二)克隆载体的选择

        (三)外源基因与载体的连接

        1.粘性末端连接

        2.平端连接

        限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端

        3.同聚物加尾连接

        由末端转移酶作用,在DNA片段末端加上同聚物序列,制造出粘性末端再连接。

        4.人工接头

        由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸,再用限制酶切产生粘性末端,进行连接。

        (四)重组DNA导入受体菌

        受体菌条件:安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态

        导入方式:转化

        转染(transfaction)

        感染(infection)

        (五)重组体的筛选

        重组DNA导入受体菌后,经过培养使其大量繁殖,再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来,这一过程即为筛选(screening)或选择(selection)。

        1.直接选择法:针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。

        抗药性标记选择(插入失活法):将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中,则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养,进行筛选。

        标志补救(marker rescue)

        若目的基因能够在宿主菌表达,且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补,就可利用对营养素的依赖表型来筛选。

        分子杂交法:利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交,直接选择并鉴定目的基因。

        原位杂交

        Southern印迹

        2.非直接选择法:

        免疫学方法:利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括:

        免疫化学方法

        酶免检测法

        (六)克隆基因的表达

        表达体系的建立:

        表达载体的构建

        受体细胞的建立

        表达产物的分离、纯化

        1. 原核表达体系

        E.coli的标准:

        选择标志

        强启动子

        翻译调控序列

        多接头克隆位点

        E.coli的不足:

        缺乏转录后加工机制

        缺乏翻译后加工机制

        表达产物形成不溶性包涵体

        很难表达大量可溶性蛋白

        2. 真核表达体系

        如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞

        优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区积累

        缺点:操作技术难、费时、不经济

        转染:将表达载体导入真核细胞的过程

        三、重组DNA技术与医学的关系

        疾病基因的发现

        发展生物制药

        DNA诊断

        基因治疗

        遗传疾病的预防

        关于基因重组,小编最后再和大家推荐3个相关的专题,一个是集合基因重组各种关键酶的实验方法的专题 ,还有就是细胞转染 专题,还有DNA连接与转化 专题,你可以对上面所提到的实验有更进一步的认识,希望大家实验开心,生活开心。

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