• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        农杆菌质粒DNA提取常规方法(不用试剂盒)

        互联网

        7120
        相关专题
        成功走出第一步:DNA提取

        一、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液体LB培养基中接种Agrobacterium 细胞,然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。然后进行质粒 提取。

        二、新鲜配制Sol II溶液(880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH),及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 µl Sol I (P1)溶液。

        三、对培养一昼夜的的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min,丢弃上清。

        四、用200 µl 5 M NaCl重悬农杆菌细胞,利用涡旋将农杆菌细胞混匀。转移到eppendorf 管中。

        五、加入20 µl 10% N-Lauroylsarcosine sodium溶液,上下倒置6-8次混匀(从不同方向倒置)。

        六、最大速度(13000 × g )下离心2 min,丢掉上清液。

        七、用200 µl含4 mg/ml Lysozyme的Sol I (P1)(Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl (8.0), 10 M EDTA (8.0))重悬沉淀,涡旋直至混匀。有时可用微量移液管头将其搅拌混匀。置于冰上。

        八、加入400 µl Sol II (P2)(Sol II: 880 µl H2O, 100 µl SDS 10%, 20 µl 10 N NaOH),上下倒置6-8次混匀(从不同方向倒置)。在冰上放置5 min。

        九、加入300 µl Sol III (P3),用手振荡。在冰上放置10 min。Sol III = Buffer P3, Neutrilization solution.

        十、最大速度(13000 × g )下离心12 min。

        十一、将上清液(700 µl)转移到新的eppendorf 管中。

        十二、用1× 酚/氯仿(Phenol/Chloroforum,350 µl Phenol +350 µl Chlororum, “Choloforum” is 24 parts chloroforum and 1 part isoamylalcohol)抽提。在通风橱中,往eppendorf 管中加入酚和氯仿(氯仿加入时要动作迅速,否则会吸入微量移液器中)。涡旋15 s,最大速度(13000 × g )下离心2 min。将上层相(700 µl)小心移入新的Eppendorf管中。倾斜吸取,防止吸入下层的酚/氯仿。注意所有使用过的吸头都放入通风橱内的有毒拉圾箱内。酚/氯仿残留液倒入通风橱下面柜子里的酚/氯仿废液瓶中。

        十三、用700 µl isopropanel沉淀,室温下放置5 min。

        十四、最大速度(13000 × g )下离心15 min,小心除去上清。可分两步,先用大移液管移走大部分上清,剩余50 µl左右再离心5 min。注意沉淀小球并不一定牢固吸在管壁上,小心不要吸走沉淀。

        十五、用70%酒精洗涤。加入1 ml 70%酒精,最大速度(13000 × g )下离心5 min,小心移去上清。室温下晾干。

        十六、20 µl TE + 10 mg/ml RNase A重悬沉淀。在冷室放置一昼夜,后贮于-20℃冰箱。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序