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        16srDNA的提取与检测方法

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        最近需要做几个菌的16srDNA PCR ,也用了变性梯度凝胶电泳(DGGE),由于新手初来乍到,请教了几个师兄,现将有关16srDNA的提取以及DGGE检测实验操作步骤总结下。

        一 样品总DNA的提取

        1 实验器材: 玻璃器材,铝盖,1.5mL离心管,螺口管,锆珠,搅拌器,4℃离心机

        2 实验试剂: PBS (0.05M,pH=7),水饱和酚,TE饱和酚,TN150,TE缓冲液,TAE缓冲液,NaAc (pH=5.2),氯仿/异戊醇(24:1)(V/V),96%冷乙醇,70%冷乙醇。

        3 实验操作:

        3.1 细胞分裂

        称取0.5g样品入含0.3g锆珠、已灭菌的screw-capped tube 中,

        加入1mL TN150,和150µL 酸性酚,bead-beater匀浆(5000rpm,3min),冰上冷却,

        加入150µL氯仿/异戊醇,涡旋混匀,

        10000rpm离心,5min

        转移上清液至已灭菌的eppendorf

        3.2 DNA提取

        加入150µL氯仿/异戊醇,和150µLTE饱和酚至上述eppendorf管中

        涡旋混匀1min,

        10000rpm离心1min,

        上清移入灭菌的eppendorf管中,

        重复上述步骤直至水相之间的界面清晰为止,

        上清移入灭菌的eppendorf管中,

        加入300µL氯仿/异戊醇,10000rpm离心1min,

        上清移入灭菌的eppendorf管中,

        加入96%冷乙醇1mL,和50µL3M NaAc (pH=5.2),

        -20℃沉淀DNA过夜。

        10000rpm离心20min

        弃上清,

        加入500µL70%冷乙醇溶解沉淀,

        10000rpm离心5min

        弃上清。风干沉淀

        加入50µLTE缓冲液溶解DNA

        -20℃保存提取的DNA

        4实验注意事项:

        酚是致癌物质,实验操作应配带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。实验中使用了挥发性有毒物质,操作应在通风橱中进行。

        实验过程中样品应放置冰面上,所有离心操作在4℃下进行。

        二、DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳

        1试剂和器材: 电泳缓冲液(undefinedTAE),溴乙锭(EB)染色贮存液(1mg/mL),0.25%溴酚兰,琼脂糖,双蒸水。

        电泳仪,水平电泳槽,透射紫外灯,胶带纸。

        2 实验操作

        2.1 1.2%琼脂糖凝胶的制备:

        ◇用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好,形成一个胶模,水平放在工作台的位置上,插入样品梳,与底面相距0.5-1mm。

        ◇称1.2g琼脂糖置于小锥形瓶中,加入100mL undefinedTAE稀释缓冲液,加热直至琼脂糖完全溶解(透明溶化液)。待冷却至60℃戴手套操作:小心加入5µLEB染色贮存液,摇匀。

        ◇将琼脂糖倒入胶模中,倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。

        ◇待凝固完全后,双手均匀用力轻轻拔出样品梳。

        ◇取下封边的胶带纸,移入电泳槽,倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3mm。

        2.2点样

        用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA与加样缓冲液(loading buffer)5:1混合后点入加样孔内。

        2.3电泳:

        100mv.电泳15-20分钟。

        2.4观察:

        紫外检测。

        3 实验注意事项:

        溴化乙锭(EB)是诱变剂,配置和使用时应带手套,且不要将该溶液洒在桌面上或地面上,凡是被其沾污的地方必须专门处理后才可进行清洗和消毒。

        加样多少取决于加样槽大小,加入样品体积应略小于加样槽体积。

        观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。

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