分子生物学常见问题解答

1、基因组DNA 的得率较低或者无基因组DNA 原因，如何解决？
1) 样品材料老化或者反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能立即处理的样品应放入液氮或-70℃低温保存，以免DNA 降解。
2) 样品破壁或者裂解不完全，DNA 未充分释放：动植物样品应在液氮中充分研磨，G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方法协助破壁。
3) 样品过多导致细胞裂解不充分：加样过多导致细胞裂解不充分，细胞裂解不充分。
4) DNA 吸附不均匀：如在上吸附柱前没有加无水乙醇，或使用低浓度乙醇代替无水乙醇，会导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶模吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量的无水乙醇，再上吸附柱使DNA 与硅胶模充分吸附。
5) DNA 洗脱不适当：洗脱缓冲液pH 过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。洗脱液体积过少（<30&mu;l），不易浸透硅胶模，使DNA不能洗脱下来，因此洗脱液体积应大于30&mu;l，超过200&mu;l，所得的DNA 浓度降低。洗脱时可以将洗脱液于65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率，加大DNA 产量。

2、基因组DNA 质量测定的问题分析。
采用分光分度测定时OD260/OD280 比值1.8，说明大量RNA 残留，没有使用RNase A，或RNase A 活性下降。

3、提取的基因组DNA 有降解，如何解决？
选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液或不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或者低温保存的样品经反复冻融导致细胞破碎，内源性核酸酶降解DNA，因此应该选用新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中应该使用干冰。
1) 未能有效的抑制内源性核酸酶的作用：某些DNase含量丰富的动植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过称中随时补充液氮，并在样品未完全解冻之前加入含有抑制核酸酶作用的裂解液。
2) 操作过于剧烈导致DNA被机械打断：预处理的样品应该加入细胞裂解以后，所有操作应该尽量柔和，避免剧烈振荡。
(责任编辑：大汉昆仑王)